免疫组化实验报告

1、免疫组化试验报告一、 仪器与试剂1.仪器：包理机：KD-BM 生物组织包埋机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；切片机：LEICA2016，德国；水浴锅：SHA-C，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；图像采集:接受OLYMPUS BX-41荧光显微镜及NIKON DIGITAL SIGHT 彩色CCD；数据分析软件:Image Pro Plus6.0 (Media Cybernetics公司；2.试剂：免疫组化染色试剂盒: Histostain-Plus Mouse Primary (Cat. No. 85-6643, Invitrogen, USA) Histostain-Plus Rabbi

2、t Primary(Cat. No. 85-6743, Invitrogen, USA)试剂A （蓝色液体）： 封闭用正常山羊血清工作液 试剂B （黄色液体）： 生物素化二抗工作液 试剂C （橙色液体）： 辣根酶标记链霉卵白素工作液DAB Kit (Cat. No. 00-2014, Invitrogen, USA)二、石蜡包埋法 1.组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。 2.预备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。 3

3、.快速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。 4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需留意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透亮蜡膜时，浸入冷水中快速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。 5.蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，马上修切，预备制成切片或贮存备用。 二石蜡包埋的留意事项 1: 取材和固定：依据客户要求将切取3mm大小的组织块。2: 脱水和透亮：  酒精（min）酒精（min）酒精（min）无水酒精（min）无水酒精（min）二甲苯、（min）<2mm45-6045-6045-6015-302-4mm60-12060-12

4、060-120304-5mm120-240120-240120-240603：浸蜡和包埋：浸蜡：将透亮的组织放入蜡杯（）蜡杯（）蜡杯（），一般总的浸蜡时间为小时左右。:4：包埋：1）组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。 2）预备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。 3）快速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。4）待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需留意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至

5、蜡面有透亮蜡膜时，浸入冷水中快速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。5）蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，马上修切，预备制成切片或贮存备用。5：切片制作：1）.室温过高时，可将修好的蜡块放到冰箱中冷却肯定时间。在夏季时可用冰块冷却刀和组织块，削减刀与组织块在过程中产生的热时，使石蜡保持合适的硬度以利于切片。2）.切片经30%的乙醇初展后，再用载玻片捞起蜡带放入展片仪水盒内（一般水温为45左右）。待蜡片带中的组织展平后，即可进行分片和捞片。3）. 切片时要准时清洁刀口、除去蜡屑，否则易引起裂开。6：贴片：待切片在恒温水内充分摊开展平后，将载玻片垂直插入水中以毛面轻靠切片，并用毛笔将切片一边拨于

6、玻片上，随即将玻片直立提起。三、免疫组化:1) 取出并恢复至室温，PBS冲洗，3分钟×3次。2) 3% H2O2去离子水（无色液体）孵育10分钟，以消退内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗，3分钟×3次。 3) 滴加试剂A（蓝色液体封闭用正常血清工作液）室温孵育20分钟，倾去，勿洗。 4) 滴加依据：LC3: 1:100, LAMP-2: 1:100比例稀释的一抗放入湿盒内4过夜 5) 取出并恢复至室温，PBS冲洗，3分钟×3次。 6) 滴加试剂B（黄色液体生物素化二抗工作液），室温或37孵育1015分钟。7) PBS冲洗，3分钟×3次。8) 滴加试剂C（橙色液体辣根酶标记链霉卵白素工作液），室温37孵育15分钟。9) PBS冲洗，3分钟