化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验

1、化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验一、材料与方法1. 实验材料1.1实验材料Hela细胞（宫颈癌细胞）、Eca-706细胞(食管癌细胞)、PC-12细胞（神经胶质瘤细胞）、53种化合物1.2主要仪器CO2恒温培养箱：力申HF151生物安全柜：阿尔泰实验室设备（北京）有限公司BHC-1300A2低速大容量离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司LC-4016相差倒置显微镜：宁波舜宇仪器有限公司XD30高端研究级倒置显微：德国蔡司Axio Observer A1恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂H21-4液氮罐：成都金凤液氮容器有限公司YDS-65-216分析天平：赛多利斯科学仪器（北京

2、）有限公司BSA224S-CW全光栅酶标仪：美国莫赛飞世尔Mltiskan GO调速多用振荡器：金坛市华峰仪器有限公司HY-4KQ5200DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司1.3主要试剂 表1名称厂家货号/批号PBS磷酸盐缓冲液粉剂北京中杉金桥ZLI-9062胎牛血清美国Hyclone16000-004,Lot#GM K0070DMEM培养基（高糖）美国gibco12800-017 ,Lot#16556970.25%胰酶美国gibco25200-056, Lot#1627654青霉素-链霉素双抗美国gibco15140-122 ,Lot#1631430MTT（噻唑蓝）美国sigma

3、M-2128DMSO（二甲基亚砜）美国sigma67-68-5，Lot#67-68-5CCK-8上海贝博BB-4202-2，BB150011 2. 实验方法2.1试剂配制、抗体稀释及53种化合物的溶解 DMEM培养基：DMEM培养基粉末溶于1L经0.22µm孔径滤膜过滤后的超纯水中，用NaHCO3调PH值至7.2-7.6之间。10%血清完全培养基：10ml的胎牛血清加入90ml的DMEM培养基中，添加1ml的青-链霉素双抗溶液。MTT溶液：称取150mgMTT，溶于30ml未过滤的PBS中，用0.22 m的滤膜过滤后待用。53种化合物的浓溶液：10mg化合物加入200l DMSO溶解

4、，再加9.80 ml完全培养基配成终浓度为1mg/ml的化合物浓溶液（有些化合物200l DMSO不能溶解，具体DMSO用量见结果与分析）。冻存液：6ml无血清培养基中加入3ml胎牛血清和1ml DMSO（培养基：血清：DMSO=6:3:1）。2.2 Hela细胞、Eca-706细胞、PC-12细胞培养基本操作方法2.2.1细胞复苏1、从液氮中取出冻存的细胞，立刻置于37水浴锅中快速晃动冻存管使细胞快速解冻；2、将细胞转移至15ml离心管中，1000rpm，6min离心后，弃培养基；3、用DMEM完全培养基 1ml重悬细胞，并接种到25ml培养瓶中；4、显微镜下观察细胞密度合适并且无细胞聚团后

5、，置于37，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养。2.2.2细胞传代1、观察培养瓶中细胞贴壁融合达90%时，即可进行细胞的传代2、开启生物安全柜紫外消毒30min，以75%乙醇擦拭台面灭菌，并预先准备细胞培养瓶、15ml离心管、无菌过滤的PBS、0.25%胰酶溶液、DMEM完全培养基，3、取出长满细胞的培养瓶，倒空瓶中的培养基，加入2ml过滤灭菌的PBS缓冲液反复冲洗2遍，倒空PBS缓冲液，每瓶中加入1ml的0.25%的胰酶溶液，使胰酶溶液平铺在细胞层面上，缓缓摇动细胞培养瓶，待细胞70%脱落时加入1ml的DMEM完全培养基终止胰酶的消化作用，并用1ml移液器反复冲洗培养瓶底将未脱落的细胞冲洗

6、下来，转移液体至15ml的离心管中，1800rpm离心5min，小心吸弃离心管中的液体，并用1ml的完全培养基重悬沉淀的细胞，倒置显微镜下观察细胞调整合适的细胞密度接种到培养瓶中于37，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养。2.2.3细胞冻存1、消化、离心步骤同细胞传代；2、离心后弃去培养基，加入1ml的细胞冻存液重悬混匀后移至2ml的冻存管中；3、冻存管中细胞经4（30min）、-20（30min）、-80（过夜）的程序降温后，转移至液氮中冻存。2.3 MTT法对53种化合物的筛查实验2.3.1 Hela细胞、Eca-706细胞、PC-12细胞的接种1、消化、离心、重悬的步骤同细胞传代；2、

7、取50l细胞悬液用于细胞计数板进行计数，计数后调整细胞浓度至1 ×105个/ml待用；3、将细胞接种到96孔板中，接种Hela和PC-12细胞时每孔加50 l细胞悬液（5000个细胞/孔），接种Eca-706时每孔加100 l细胞悬液（10000个细胞/孔），每孔用完全培养基补加至200 l，边缘孔用200l无菌PBS进行填充。 4、将接种好的细胞放入37，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养。2.3.2 Hela细胞、Eca-706细胞、PC-12细胞的饥饿处理1、显微镜下观察待96孔板中的细胞铺至孔底约50%时开始进行饥饿处理（其中Hela和Eca-706细胞培养24h，PC-1

8、2细胞培养约65h）；2、具体操作步骤：先弃去96孔板中的DMEM完全培养基，用无菌PBS洗去残留的培养基后，加入无血清的DMEM培养基，放入37，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养。2.3.3 对Hela细胞、Eca-706细胞、PC-12细胞分别进行化合物处理1、进行饥饿处理24h以后，在显微镜下观察细胞的生长状态；2、加入浓度梯度的化合物，每种化合物设置6个浓度梯度3个重复，所配化合物原浓度为1mg/ml，设置的6个浓度梯度分别为20g/ml、10g/ml、5g/ml、2.5g/ml、1.25g/ml、0.625g/ml；3、阳性对照：顺铂（顺铂的6个浓度梯度同化合物相同）空白对照：只

9、加含化合物培养基阴性对照：加完全培养基和细胞4、37，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养24h后，显微镜下观察不同化合物对细胞的作用效果。2.3.4 MTT检测1、对上述化合物处理后的细胞每孔加入20l MTT溶液（终浓度0.5mg/ml，即0.5%MTT），继续放入37，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中孵育；2、孵育4h后，弃掉上清，每孔加入150 l DMSO，并在调速多用振荡器上低速震荡10min使结晶充分溶解（甲瓒）；3、酶标仪检测490nm吸光值，并记录数据。2.3.5 利用CCK-8做出Hela细胞、Eca-706细胞、PC-12细胞的生长曲线1、接种细胞：Hela细胞、Eca-

10、706细胞、PC-12细胞的分别接种4000个/孔、5000个/孔、5000个/孔，每组5个重复，共8个时间点，每孔用完全培养基补至200 l体系，放入37，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养24h。2、饥饿处理接种细胞培养24h后，饥饿处理24h，之后更换完全培养基，开始计时0h；3、分别在1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h加入cck-8 20l进行检测（加入CCK-8后3h分别检测450nm波长吸光值），并记录数据。二、结果与分析1、化合物的溶解情况1.1 化合物溶解方法化合物使用含有1/ 50 DMSO的完全培养基来溶解，对不溶或溶解不完全的化合物加大DMSO用量

11、溶解，DMSO的使用情况见表2：表2：DMSO体积化合物1倍体积DMSOXG-1，XG-2,XG-3,XG-4，XG-5,XG-12，XG-13，XG-16，XG-21，HCC-1，HCC-8，HCC-10，HCC-11，LY-1，LY-2，LY-4，LY-5，LY-7，LY-9，LY-10，LY-11,ZL-1，ZL-32倍体积DMSOXG-9，XG-10，XG-15，XG-19，XG-20，XG-22HCC-2，HCC-3，HCC-6，HCC-9，LY-3，LY-8，ZL-2，ZL-4，ZL-5，ZL-63倍体积DMSOXG-6,XG-7,XG-8，XG-11，XG-14，XG-17,XG

12、-18，HCC-4，HCC-5，HCC-7LY-6，ZL-84倍体积DMSOHCC-12，ZL-71.2 药物溶解后的状态统计见表3表3溶解状态化合物完全溶解LY-11，HCC-8乳状/絮状XG-1，XG-2，XG-4，XG-6，XG-7，XG-8，XG-9，XG-10，XG-11，XG-12，XG-13，XG-14，XG-15， XG-17，XG-18，XG-19，XG-20，XG-21，XG-22HCC-2，HCC-3，HCC-4，HCC-5，HCC-6，HCC-7，HCC-9，HCC-10，HCC-11，HCC-12，LY-1，LY-2，LY-3，LY-4，LY-5，LY-6，LY-7，

13、LY-8，LY-10，ZL-2，ZL-3，ZL-4，ZL-5，ZL-6，ZL-7，ZL-8析出晶体XG-3，XG-5，XG-16,LY-9，HCC-1，ZL-1图1：药物溶解状态图2、Hela细胞、Eca-706细胞、PC-12细胞化合物处理 Eca-706、PC-12、Hela细胞经化合物处理前后分别在50倍下显微镜下观察，化合物处理前细胞分布均匀，形态均一；化合物处理后，与阴性对照组对比，部分化合物组细胞形态随着浓度梯度的增加，悬浮细胞数目增加，孔内整体细胞数目减少。图2：如图所示从左到右分别是：Eca-706、PC-12、Hela细胞化合物处理前50倍显微镜下图片图3：不同浓度化合物LY

14、-2对Hela细胞处理24h后的50倍显微镜下的细胞形态图图4：不同化合物处理后MTT检测图5：不同浓度化合物XG-10对Eca-706细胞处理24h后的50倍显微镜下的细胞形态图6：不同化合物处理后MTT检测图7：不同浓度化合物XG-16对PC-12细胞处理24h后的50倍显微镜下的细胞形态图8：不同化合物处理后MTT检测3、化合物对不同肿瘤细胞的IC503.1 hela细胞不同化合物对hela细胞的IC50（浓度单位：g/ml）化合物IC50化合物IC50化合物IC50HCC-17.311LY-113.328XG-18.043HCC-20.024LY-212.270XG-25.238HCC

15、-30.286LY-30.387XG-33.037HCC-430.920LY-40.087XG-51.091HCC-58.143LY-50.356XG-628.580HCC-66.183LY-65.727XG-788.660HCC-720.120LY-83.761XG-81.898HCC-84.471LY-96.184XG-93.849HCC-90.813LY-104.550XG-100.039HCC-103.695LY-110.813XG-110.627HCC-110.193XG-120.206HCC-1233.520XG-147.290ZL-2XG-150.617ZL-3XG-1611.3

16、40ZL-4XG-177.020ZL-5a XG-180.109ZL-6XG-195.253ZL-7XG-202.129ZL-8XG-219.880顺铂47.730XG-225.5803.2 PC-12细胞不同化合物对PC-12细胞的IC50（浓度单位：g/ml）化合物IC50化合物IC50化合物IC50HCC-157.19LY-131.91XG-1274.7HCC-21.353LY-290.82XG-26.953HCC-31.776LY-326.58XG-37.768HCC-4LY-4XG-49.815HCC-5LY-53.995XG-5HCC-6LY-63.750XG-6HCC-7LY-7

17、67.93XG-7HCC-8LY-834.31XG-82.953HCC-9LY-9XG-918.55HCC-10-LY-10XG-101.657HCC-115.396LY-11XG-112.469HCC-1258.57XG-122.663ZL-2540.3XG-130.3845ZL-3XG-1416.61ZL-40.2025XG-159.320ZL-529.55XG-162.391ZL-6XG-17ZL-7XG-187.117ZL-8XG-190.5801顺铂XG-20XG-21XG-223.3 Eca-706细胞不同化合物对Eca-706细胞的IC50（浓度单位：g/ml）化合物IC50化合物IC50化合物IC50HCC-1LY-121.1XG-1HCC-21.850LY-2176.4XG-219.87HCC-33.733LY-3XG-320.22HCC-4LY-4XG-48.751HCC-527.4LY-56.986XG-524.16HCC-6109.1LY-65.120XG-622.75HCC-70.1228LY-7XG-722.13HCC-8LY-8XG-80.1618HCC-9L