细胞工程复习重点

1、思 考 题1细胞工程实验室的基本组成与要求是什么？一、实验室组成（1）基本实验室准备室/化学实验室功能： 就是进行一切与实验有关的准备工作要求： 宽敞明亮，通风条件好 ，地面便于清洁并应防滑处理。接种室/无菌操作室功能： 是进行接种、继代、细胞融合等无菌操作的场所。要求： 封闭性好，干燥清洁明亮， 防止空气对流。外应设缓冲室、更衣室，防止微生物感染。培养室功能： 是对接种到培养瓶的离体材料进行控制培养的场所。要求： 是要能控制光照和温度，应保持干燥和清洁。（2）辅助实验室 根据具体的实验需求而定。细胞学实验室生化分析室摄影室及暗室（3.） 移栽设施/温室要求：配置人工光源并且能够控制室内温度，

2、为试管苗的正常生长提供适宜的环境。2外植体消毒的基本方法是什么？ 3无菌操作在植物离体培养中的作用是什么？4. 配制培养基时，加入一定量的植物生长调节物质，它们在离体培养过程中有哪些作用? 激素调控的一般规律是什么？植物激素或生长调节剂（ growth regulators）包括：Ø 生长素类Ø 细胞分裂素类(CTK)Ø 赤霉素类 (GA)Ø 乙烯（ Eth)Ø 脱落酸(ABA)§ 其中前三者为正向激素，后两者则为负向激素。常用的主要有生长素类和细胞分裂素类两大类。§生长素类（ auxin）： 在作用或结构上类似于吲哚乙酸的

3、一类物质的统称。生长素是最早发现的植物激素。作用： 诱导愈伤组织形成，促进细胞的分裂和伸长，诱导根原基的发生和根系的生成，有调运养分的效应。使用浓度0.110mg/L。常用的生长素有:吲哚乙酸 (IAA)、2， 4，二氯苯氧乙酸 (2,4-D) Ø吲哚丁酸 (IBA) 奈乙酸 (NAA)Ø细胞分裂素类(cytokinin,CTK) ： 是一类促进细胞分裂的植物激素，细胞分裂素都为腺嘌呤的衍生物。作用： 促进细胞分裂和分化，诱导不定芽的形成，促进胚状体的发育，延缓组织的衰老，打破顶端优势，有利于芽的增殖，常用于继代和增殖培养。使用浓度0.110mg/L。常用的细胞分裂素有：&

4、#216;激动素 (KT) Ø6-苄基腺嘌呤 (6-BA/BAP) Ø玉米素 （ ZT）异戊烯氨基嘌呤 (2-ip) Ø噻重氮苯基脲 （ TDZ） 5. 常用的植物细胞培养基种类有哪些？各有什么特点?MS培养基无机盐含量较高，微量元素种类较全，浓度也高。其养分的数量和比例较合适，离子平衡性较好，具较强的缓冲能力，培养过程中较稳定，可满足植物的营养和生理需要。其中它的硝酸盐含量较其它培养基为高。广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。6 培养基3和（4） 24 含量高，VB1含量高，不含钼。目前在国内已广泛应用于小麦、水

5、稻及其它植物的花粉和花药培养和组织培养。5培养基3含量高，有机物含量较高，但含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物H培养基大量元素约为1/2MS，微量元素减少但含量增加，维生素种类较多。用于多种植物的花药、胚培养。hite 培养基特点：是无机盐浓度较低，有机成分含量也相对较低。适于生根培养。-培养基有机成分较复杂。它包括了所有的单糖和维生素。广泛用于原生质体和融合体的培养。6简要说明MS培养基的基本组成。7. 配制培养基时，为什么要先配母液?如何配制母液?在组织培养工作中， 配制培养基是日常工作，为了简便起见，将培

6、养基配方中的药品配成一定倍数的浓缩液，用时稀释，这种浓缩液就是母液贮备液。母液储备液可一次称量供一段时间使用， 简单方便，不仅可以提高培养基中微量成份称量的准确性， 还可以减少工作量，提高效率。§ 母液贮备液的配制要求ü大量元素母液配制： 10x， 20x， 50xü微量元素母液配制： 1000xü铁盐母液配制： 100x或200x , 分别溶解EDTA-Na2 与FeSO4· 4H2O，再充分混匀，贮存在棕色瓶中ü有机母液配制：可以分别配制100200X，也可以混在一起配制ü肌醇一般单独配置成100x。ü生长调节

7、物质配制：分别单独配制成母液，储存于冰箱。一般浓度为0.11 mgml。并注意不同激素需加入不同助溶剂8. 如何判断配制好的培养基是否良好？9. 植物培养基和微生物培养基有什么不同？第三章1植物细胞全能性的含义是什么？其实现的途径是什么？每个植物生活细胞无论是体细胞还是生殖细胞，均具有该物种全部的遗传信息。每个植物生活细胞均具有发育成完整植株的潜在能力。细胞全能性仅是一种能力或可能性，不是所有具有全能性的细胞都能进行全能性的表达。离体培养条件下，植物体细胞、性细胞、原生质体、经过遗传信息修饰的细胞都可能实现细胞全能性2什么是细胞脱分化和再分化？其实现的条件是什么？脱分化（ dedifferen

8、tiation） ： 培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程。再分化（ Redifferentiation）： 脱分化后的分生细胞在特定的条件下，重新回复细胞分化能力，形成各种不同类型的细胞，并经历器官发生或胚胎发生，进一步发育成完整植物体的过程细胞脱分化的条件： 创伤、外源激素。3什么是器官发生，器官发生的方式有几种？各有什么特点？直接和间接器官发生的区别是什么？器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定芽（ adventitious buds）、不定根（ adventitious roots）等器官的过程5. 器官发生的影响因素有哪些？1、

9、起始材料ü母体植株的遗传基础ü外植体的类型ü生理状态、取材方式等2、培养基成分激素（ Skoog-Miller模式）、有机及无机成分3、培养条件光照、温度、湿度等6体细胞胚的概念、含义及特点是什么？体细胞胚(somatic embryo)或胚状体（ embryoid） ：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发生和发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞）体细胞胚的含义：Ø在离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚；Ø体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚；Ø体细胞经过了胚胎发育过程，以区别与离体培养中器官发生

10、形成个体的途径体细胞胚发生的特点Ø 具有明显的双极性： 即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，具有根、芽两极分化的特性；Ø 存在生理隔离现象：胚状体与母体组织或与外植体的维管组织无解剖结构上的直接联系，处于相对独立的状态；Ø遗传的相对稳定性：单细胞起源；发生数量大， 增殖率高：可再生次级胚7体细胞胚发育的过程是什么？它和器官发生形成的芽、合子胚有什么区别？8什么是胚性和非胚性愈伤组织？9外源激素对体细胞胚胎发生有什么影响？生长素是诱导体细胞胚的主导因子。 体细胞胚胎发生中，外源生长素的使用规律，在大多数植物中是相似的。诱导愈伤组织或胚性愈伤组织，

11、均需要高浓度的生长素；当球型胚形成后，则需要降低生长素水平才能完成体细胞胚的继续发育；生长素的这一应用规律与胚胎发育过程中内源激素的变化是一致的10如何进行愈伤组织的继代培养？多次继代培养的愈伤组织其分化能力如何？为什么？愈伤组织在诱导培养基上生长一段时间后，保持其的旺盛分裂能力、均一的细胞群体，避其死亡，必须进行继代培养。继代培养时期：旺盛分裂时期；培养方法：分割成小块，约5mm3大小；培养方式： 固体培养、液体培养。培养基： 与初代培养相同，或适当降低激素浓度或调控激素比例。愈伤组织形态发生潜力的丧失u原因： 生理学说： 培养组织或细胞中的内源激素失衡。遗传学说： 遗传物质在培养继代过程中

12、由于变异等原因而发生了改变或是突变。竞争学说： 细胞对于生长素抑制全能性表达的作用变得比较敏感；反复的继代培养中，非胚性细胞的群体将会逐步增加，而胚性成分则逐渐减少。11.人工种子的概念及其结构。人工种子又称合成种子 （synthetic seeds）或体细胞种子 （somatic seeds）：是指将植物离体培养中产生的体细胞胚，或能发育成完整植株的分生组织（ 不定芽、愈伤组织、胚状体、原球茎、小鳞茎、微型薯等）包埋在含有营养物质和具有保护功能的外壳形成的适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。12.人工种子研制有什么意义？如何看待人工种子的发展前景及面临的困难？人工种子的研制意义（ 1）人工种子能

13、代替试管苗快速繁殖，开创了种苗生产的又一新途径。与试管苗相比是一种高效快速的繁殖方法，避免移栽困难，易于实现机械化操作，便于储运。（ 2）对优异杂种种子、自然条件下不结实或制种困难的植物可以不通过有性制种而快速获得大量种子。（ 3）在人工种子的包裹材料里加入各种生长调节物质、菌肥、农药等，可人为地影响控制作物生长发育和抗性。人工种子存在的问题l 许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细胞胚。l 现有的人工胚乳和种皮还不够理想， 不能有效地防止微生物的腐蚀。l 人工种子的贮藏有待进一步完善。l 人工种子的成本远高于自然种子发展前景人工种子的发展前景是客观的它将是农业中一种革命性的繁殖系统，相信

14、该技术会得到逐步完善，建立多种模式来研制人工种子，并逐步扩大应用范围。第四章1.离体快速繁殖一般可分为哪几个阶段？简述其操作的一般程序。繁殖过程划分为四个阶段无菌培养物的建立（ stage1）程 序：外植体的选择、消毒、接种和培养增殖培养（ stage2）方 法：反复进行、连续的培养试管苗生根（ stage3）方法： 降低或去除细胞分裂素，增加碳源。植物类型不同，壮苗培养时可以以单个的枝或丛状的芽苗进行。试管苗的移植（ stage4）移栽的一般步骤：1） .开瓶锻炼：放在较强光照条件下或温室中，打开瓶口，锻炼12周左右；2） .试管苗就可以从培养瓶内取出，小心的洗去根上附着的培养基，移栽进合适

15、的基质中；3） .精心管理，直至成活；4） .进一步培育成商品苗。2. 快速繁殖中，培养物的增殖途径有哪几种?各有何特点？（1）、腋生枝型以顶芽和腋芽发育进行增殖的特点：利用外植体上已有的芽分生组织，促使其萌发形成枝条或芽， 方法简单，能高度保持遗传稳定性，繁殖速度较慢。适用于绝大多数植物的繁殖，对具有特殊观赏价值的嵌合体(chimera)园艺植物来说，也是唯一能够保持其原有嵌合特性的繁殖途径。（2）、不定芽型不定芽增殖的特直接分化途径产生的不定芽：遗传稳定、繁殖速度较快间接分化途径产生的不定芽：容易产生变异点：利用不定芽增殖对于繁殖园艺上的嵌合体（ chimera）植物来说，容易引起嵌合体的

16、分离。3、体细胞胚（ somatic embryo）型特 点：最理想的繁殖方式，增殖系数高；遗传相对稳定；具有双极性结构，可以免去生根步骤；有利于实行机械化操作。目前只有少数植物能产生胚状体，再生植株有返幼特性3.试管苗有什么特点？试管苗的特点Ø叶的特点 ： 叶面积较小，功能不全，易失水，合作用能力低。Ø根的特点 ： 无根或生根率低，根与茎输导组织不相通，根吸收功能低。Ø茎的特点： 有的植物茎的输导组织发育也不完善，木质化程度低。Ø光合作用能力： 增殖阶段，试管苗基本处于异养状态，很少或不进行光合作用；生根阶段，异养兼自养。4.外植体选择应注意哪些问题？

17、供体植株的基因型： 遗传性状是否优良？培养难易？实用价值？Ø外植体类型： 取材难易？再生难易？遗传变异？Ø增殖类型： 诱导的难易？繁殖速度？遗传稳定性？5.植物离体快速无性繁殖有什么特点？主要适用于哪些植物类型？起始材料少，生长周期短、繁殖速度“快” ，每年以数万倍乃至数百万倍的速度进行繁殖，不受自然条件干扰，实现工厂化育苗；p生产无病毒种苗，防止品种退化； 体积微小、不携带病原菌，便于储运和种质材料交换，减少病虫害的传播；能够有效地保持优良品种的特性，使原来难以通过无性繁殖的植株进行无性繁p殖。已广泛应用于花卉、 蔬菜、 果树、药材和林木的种苗生产。6.防治植物病毒病有哪

18、些方法？物理方法： X射线、紫外线、超短波、高温热处理等。钝化病毒，从而达到抑制病毒蔓延的目的。化学方法：采用化学抑制剂，干扰病毒在植物体内的复制。生物学方法：选用抗病毒品种、采用种子繁殖或茎尖培养等方法。7.简述茎尖分生组织培养脱毒的一般方法。（1）供体植株的选择和预处理供体植株的选择： 了解植物病毒种类及分布，确定茎尖大小，材料的典型性，外植体健康程度等。预处理： 茎尖培养可与热处理、化学疗法相结合。（2）茎尖组织的分离顶芽、侧芽等表面消毒解剖镜下无菌操作去除幼叶、叶原基切取含1-2个叶原基的生长点（ 0.10.2mm） 即刻转入培养基。（3）茎尖分生组织的培养常用的培养基有MS、 Whi

19、te、 Morel、农事场、革新等配方8.影响茎尖分生组织培养去除病毒的因素都有哪些?9.病毒检测的方法？1、 指示植物鉴定法2、血清学鉴定法3、电子显微镜检查法4、分子检测法10.如何进行无病毒苗的保存和繁殖？第五章 植物细胞培养和次生代谢产物生产1.植物单细胞培养的方法有哪些？1、平板培养（ plating culture）2、悬浮培养（ suspension culture）3、看护培养（ nursing culture）4、微室培养（ micro-chamber culture）5、饲养层培养（ feeder layer culture）2.一个好的悬浮细胞系有哪些特征？Ø

20、分散性良好：悬浮培养液中的细胞团较小。Ø 均一性好：细胞形状和细胞团大小大致相同。Ø 细胞生长迅速：细胞生长量一般23d甚至更短时间便可增加一倍3. 植物细胞大规模培养有哪些培养系统？各有什么特点？1、分批培养培养系统封闭，只允许气体和挥发性代谢物质与外界交换；ü培养基体积固定，当其中的营养物质耗尽时，细胞即停止生长；ü为使成批培养的细胞不断增殖，必须在悬浮培养液达最大重量时尽快进行继代培养；ü用适当的搅拌方法使游离细胞和小细胞团在培养液中均匀分布；操作简单，可直接放大。ü 2、连续培养通过调节流入和流出培养液的速度可使培养细胞生长速

21、度相对一致，形成一个相对稳定的培养状态，使细胞保持在对数生长期。一直有细胞收获，但浓度不高，细胞分裂快，易变异，开放式的培养易造成污染，对设备复杂，技术要求较高。4. 植物细胞固定化的常用方法有哪些？为什么说植物细胞固定化培养更有利于次生生物的生成？按照其支持物不同可分为两类包埋式固定化培养系统：常用的支持物有琼脂、琼脂糖、藻酸盐、胶原蛋白、聚丙烯酰胺等；附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。5. 培养条件下植物细胞生长与次生产物合成的关系有哪几类？生长偶联型： 产物合成发生在细胞生长过程中，到达静止期后合成停止。Ø非生长偶联型： 产物合成出现在细胞生长

22、停止时。Ø中间型： 产物合成出现在细胞生长开始下降时合成，细胞处于对数生长期或停止生长期时产物都不合成。6.影响植物次生产物合成的因素有哪些？通过哪些途径可以提高植物培养细胞次生代谢产物的产量？细胞系： 选择稳定高产的细胞系。培养工艺：诱导子的添加、前体饲喂、添加竞争途径代谢产物抑制剂、培养基和培养条件优化与控制等。培养技术： 固定化培养技术、两步培养法、两相培养技术。 培养设备： 选择或设计合适的生物反应器。第六章 植物原生质体培养与体细胞杂交1. 原生质体、亚原生质体、核质体、胞质体的概念。原生质体(protoplast) ：去掉细胞壁的细胞或是由质膜包裹的具有生活力的裸露细胞。

23、亚原生质体(subprotoplast)： 在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体，它可以具有细胞核或没有细胞核。核质体(nuclearplast)： 由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。胞质体（ cytoplast） ： 不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体2. 原生质体培养的方法。3. 为什么原生质体要培养在等渗培养基中？培养过程中如何管理？原生质体培养过程中的管理及时添加新鲜培养基Ø 逐步降低培养基的渗透压Ø 及时调整培养基中的激素成份4. 影响原生质体培养的主要因素有哪些？（1）、原生质体的活力（2、）原生质体的起始

24、密度（3、）原生质体的营养和环境（4、）基因型5. 细胞融合有哪几类？（1）自发融合（ spontaneous fusion） ：去壁后的同种原生质体之间常发生融合形成同核体，频率一般在830%之间。它是由于不同细胞间胞间连丝的扩展和粘联造成的，不属于细胞杂交的范畴。（2）诱导融合：过人工诱导的方式，使不同来源的原生质体之间发生融合，形成异核体.6. 简述PEG融合与电融合的原理及各自特点。PEG的作用机理：PEG分子具有轻微的负极性，可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果使原生质体发生粘连。在洗脱过程中， PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷

25、重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。PEG诱导融合的特点优点：q融合成本低，勿需特殊设备；q异核率较高， 可重复性强；qPEG诱导的融合过程不受物种限制；q毒性低。缺点：q融合过程繁琐；q一些植物种原生质体质膜性质强弱不一,常出现对PEG敏感,而破碎的现象；qPEG的分子量大小,浓度高低的使用不当也可影响融合的效果电融原理：q当原生质体处于电导率很低的溶液中时，通电后电流即通过原生质体，在非均匀的交变电场中时，发生双向电泳而进入电场反应强的区域，同时，原生质体在电场作用下，发生极化而产生偶极子，使原生质体沿电场线

26、运动，细胞紧密接触排列成串；然后给予短暂的高压脉冲，导致接触面的细胞膜击穿，随后紧密接触的细胞膜发生结合，导致细胞融合。为了稳定这个过程，在短期内需要施加交流电压。（ 2）电融合的优点：ü不存在对原生质体的毒害问题；ü融合效率高，重复性好，融合率达60以上；ü融合技术操作简便，对融合原生质体数易于控制等。 7. 原生质体融合的基本过程是什么？膜融合、胞质融合和核融合8. 杂种细胞的选择方法有哪些？1. 细胞系互补选择法2. 物理特性差异选择法3. 生长特性差异选择法9. 体细胞杂种的鉴定方法有哪些？10. 什么是细胞质杂种？胞质杂种有什么作用？（三）细胞质杂种（

27、cybrid）细胞质杂种： 指具有一个亲本的核，而细胞质为杂合或另一亲本的体细胞杂种。由以下途径产生对称融合： 融合后的某一阶段一个亲本的核或染色体被排除。不对称融合： 使一个亲本的核失活或去核。细胞质杂种的意义：为核外遗传物质交流重组及研究核质互作提供了机会。第七章 植物花药和花粉培养及单倍体育种1通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？花药培养花粉培养未授粉子房/胚珠培养2花药培养中如何选择外植体？（ 1）供体材料选择：供试材料的遗传背景：选择易培养的材料、杂合性的材料。供试材料的生理状态：开花期的早晚、生长环境、营养状态等（ 2）花粉的发育时期选择：只有花粉发育到一定时期对离体培养最敏感，才

28、可能被诱导产生愈伤或胚状体。一般情况下，对大多数植物来说，在单核期的花粉比较容易培养成功。单核中晚期到有丝分裂期是最适培养时期。3花药培养与花粉培养有什么不同？共同点： 培养目的相同，获得单倍体植株。n不同点： 花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养；花粉培养没有药壁组织干扰，易于观察雄核发育的全过程，技术更复杂4花药培养过程中花药为什么要经过低温处理？（1）降低了小孢子新陈代谢，延长花粉的寿命,中断正常的配子体发育，促进花药营养成分的转运；（2）低温能改变纺锤丝的轴向, 破坏纺锤丝的微管蛋白而阻止纺锤丝形成，打破有丝分裂正常过程, 导致细胞分化；（3）阻止了细胞在预处理时的细胞周期，一

29、旦培养在25度-28度下重新返回有丝分裂；（4）低温、饥饿胁迫作用。5何谓花粉的二型性和E花粉？天然花粉群体（同一花药）中，存在两类不同的花粉。一类为正常花粉，它们的细胞质较浓，发育较一致，染色较深；另一类为异常花粉，其特征是花粉体积较小，细胞质较淡、染色较浅，发育迟缓 (Dunwell， 1992)。Sunderland等在研究花药培养的发育途径中发现后一类花粉具有雄核发育能力，形成花粉胚，因此称为胚性花粉或E花粉6花粉植株的发生主要有哪些途径？（1）培养初期小孢子的发育途径1、小孢子的发育途径2. 营养核发育途径3. 生殖核发育途径4. 由生殖核、营养核共同发育途径（2、）培养晚期小孢子的

30、发育过程通过胚状体形成花粉植株通过愈伤组织分化形成花粉植株7. 单倍体的特点是什么？体细胞染色体数减半；生长发育弱，体形小、各器官明显减小； 雌、雄配子严重败育，有的不能进入有性世代。8. 花药培养的一般程序？（1.）材料准备（2）.花药接种及诱导培养（3.）分化培养（4）.生根、壮苗培养及驯化移植（5.）单倍体植株的鉴定及其二倍化第八章、植物胚胎培养1胚胎培养、胚培养、 “ 胚挽救” 的概念。胚培养（ embryo culture）：指在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来，置于培养基上进行培养的技术。胚挽救” 技术：一些植物由于胚发育不良或中途败育等生殖障碍，导致种子不能萌发；在远缘杂交中

31、， 杂种的不亲和性，使杂种胚在发育过程中途败育等；可以利用胚胎培养技术，分离发育不良的种子，或即将败育前的种胚进行培养，促使胚继续发育至成熟，使杂交育种或远缘杂交获得成功，这种技术称为“胚挽救” 技术胚胎培养：对植物胚及胚器官（胚乳、胚珠、子房）的离体培养。2. 胚培养的类型有哪两种？离体胚培养有什么意义？胚培养一般包括幼胚培养和成熟胚培养两种方式。植物胚培养的意义（1、）用于胚的挽救（2、）打破种子的休眠，提早结实，缩短育种年限（3、）使生活力低下或无活力的种子萌发（4、）克服珠心胚的干扰，使植物合子胚正常发育（5、）种子活力的快速测定（6、）诱导胚性愈伤及建立高频再生体系（7、）用于理论研

32、究3. 幼胚培养时胚的发育方式有哪几种？各有何特点？（1、）胚性发育(embryonal development)/合子胚发育幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚，再按种子萌发途径出苗形成完整植株。（2、）早熟萌发(precocious germination) 幼胚接种后，离体胚不继续其胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发。（3、）脱分化形成愈伤组织(callus)幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。愈伤组织可分化为胚状体或不定芽。4什么是早熟萌发？如何克服？幼胚早熟萌发：在含有无机盐、 有机物和蔗糖的培养基上，离体培养的幼

33、胚越过正常胚胎发育阶段， 在未达到生理和形态成熟的情况下， 萌发长成幼苗， 称早熟萌发。 早熟萌发成的幼苗往往畸形、细弱，甚至不能存活防止幼胚早熟萌发的方法： 提高培养基渗透压胚龄越小要求的渗透压（ 糖浓度） 越高；提高无机盐浓度， 可加入适量的NaCl以提高渗透压， 浓度一般为0 20 4， 超过0 8对胚有毒害作用；加人1 l5 5甘露醇提高渗透压， 甘露醇可以部分地代替蔗糖， 使幼胚在等渗条件下继续胚性发育ü5在实际操作中如何确定胚囊的发育时期？最好的办法是根据胚囊发育时期和花粉发育时期的相关性来确定胚囊发育时期6植物胚乳有哪些类型？胚乳培养的最适宜时期是什么时间？胚乳培养有什

34、么作用和意义？被子植物胚乳按发育初期是否形成细胞壁可三种类型：A、核型胚乳（ nuclear type）B、细胞型胚乳（ cellular type）C、沼生目型胚乳（ helobial type）胚乳发育时期可分为：早期、旺盛生长期和成熟期， 旺盛生长期是取材的最佳时期。意义：（1）再生植株多为三倍体，产生无籽果实；（2）可以从胚乳愈伤中分离和筛选各种类型的非整倍体植株；Ø（3）研究胚和胚乳的关系及胚乳组织的功能；Ø（4）胚乳细胞是研究淀粉、蛋白质和脂类天然产物代谢途径的理想系统；Ø（5）胚乳培养再生植株证明了全能性理论7离体授粉、受精的意义是什么？简述其一般方

35、法。克服远源杂交不孕克服自交不亲和性诱导单倍体植株用于花粉生理和受精生理的研究胚珠授粉方法哺育法：将胚珠表面先蘸满有助于花粉发然后撒上花粉进行培养。该法是解决胚珠存活率和花粉发芽、花粉发生矛盾时的做法。柱头接近法：将花粉撒在本种植物的柱头上，切下柱头接种在培养基上，然后在柱头周围接种异种植物裸露胚珠，花粉在本种植物的柱头哺育下发芽，花粉管伸长并进入胚珠受精。该法使解决花粉发芽和胚珠培养在培养基组成上发生矛盾时所采用的方法子房授粉方法：花粉涂抹法：毛笔粘取花粉，涂抹于柱头，或在剥离子房时用柱头直接粘取花粉后培养。花粉悬液注射或引入法 ：在子房壁或顶端切开一个小口，把花粉悬液用无菌微量注射器注入，

36、或引入子房，进行培养。ü花粉悬液： 10-20mg/L硼酸+5蔗糖，每滴悬液含花粉100-300粒第九章 植物体细胞无性系变异及突变体筛选1体细胞培养物的遗传变异有何特点？（1）、体细胞无性系变异的普遍性变异可发生在各种培养类型中；变异发生在各种植物的培养中。（2）、体细胞无性系变异的局限性与自然发生的变异、理化诱变的变异类型相似。表型上： 主要是植株形态、生长势、育性、某些抗性等性状的变异；生理生化上： 容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异；遗传上： 涉及单基因或多基因性状、隐性或显性突变。3、体细胞无性系变异的嵌合性嵌合性： 指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，它是组织

37、培养中常见的现象。2哪些因素会影响培养物的遗传变异？1、供体植物供体植物倍性水平：正常二倍体的稳定基因型：遗传背景纯合的稳定外植体来源：分化程度高的易变异2、 培养基及培养方式培养方式、激素及其它附加成分均会诱导体细胞变异的发生。3、 继代培养的时间及植株再生方式继代时间越长，细胞变异的几率就越高；顶芽和腋芽的再生方式变异少，间接再生方式变异多。3从细胞学和分子生物学机制上理解体细胞无性系变异的机制。细胞层次上：染色体数目与结构的变异1、 DNA核内重复复制： DNA在核内重复复制，但不发生细胞分裂，其结果是染色体组数增加，形成同源多倍体。2、染色体断裂与重组： 结果是在体细胞中出现染色体易位

38、、缺失、倒位等多种类型的结构变异。3、非正常有丝分裂： 结果出现染色体的非整倍性变异分子层次上：点突变DNA 总量变异转座因子的激活 DNA 甲基化变化细胞器DNA 的修饰4体细胞无性系变异的诱导和选择方法。培养细胞的诱发变异诱变方法1）物理诱变2）化学诱变3）复合因子诱变4）转座子插入诱变体细胞突变体的筛选方法（1）在田间从再生植株中选择有用的细胞突变体通过田间观察、考种来发现和选择有用性状的变异植株，是一种最简单、直接的方法。（2）在细胞水平利用选择压选择有用的细胞突变体在细胞、愈伤组织或器官培养阶段向培养基中加入选择压，从而选择出有用的抗性细胞系。5体细胞无性系变异的应用途径。Ø

39、; 农业上： 创造育种中间材料或直接筛选新品种；Ø 次生代谢物生产中： 高产细胞系的筛选；Ø 理论研究中： 遗传研究、发育生物学研究、生化代谢途径研究1. 动物细胞工程无菌操作的基本要点有哪些？1）紫外线只对能照射到的部位有消毒杀菌作用，故台面上的物品不要放置过多或重叠放置；紫外线照射期间台面上勿放置培养用品和培养用液等，以免受射线影响；紫外线对台面流动的空气无意义，空气的消毒靠超净工作台的空气过滤装置。（2）烧过的器械要冷却后才能使用，如镊子应冷却后才能夹取组织，否则可能造成组织细胞损伤；塑料、橡胶器件宜用75%酒精擦洗，勿将酒精接触里面。胶塞、橡皮头等过灯时时间要短，以

40、免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。（3）已吸过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管内培养液中的蛋白质等成分烧焦后会产生有害物质，吸管再用时会将其带如培养液中；（4）开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短，防止因温度过高烧死细胞；（5）进行培养操作时，不要用手触及已消毒物品，如不慎接触，要用火焰烧灼或取备用品更换（6）吸取不同液体、处理不同的细胞要用不同的吸管，以避免液体间、细胞间的交叉污染。（7）面向操作野时勿大声讲话或咳嗽，以免喷出的唾沫把细菌等带入工作台面造成污染。（8）操作人员应注意自身安全。（9）操作完毕后，清理物品，75%酒精擦洗台面。2.动物细胞培养液的主要成分有哪些

41、，在离体培养中的作用是什么？动物细胞对培养基要求高葡萄糖、必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、细胞生长因子及激素、贴附因子等。1.葡萄糖： 碳水化合物是细胞生长主要能量来源,其中有的是合成蛋白质和核酸的成分.主要有葡萄糖,核糖,脱氧核糖,丙酮酸钠和醋酸等。细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。2、氨基酸：是细胞合成蛋白质的原料。在培养基中添加至少12种必须氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸。此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的来源，在

42、缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡.3.维生素：主要扮演辅酶、辅基的角色，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基常有的成分。4.无机离子与微量元素：培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡.此外,通过提供钠,钾和钙离子,帮助细胞调节细胞膜功能.培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg 320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动.细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素，还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。 5、生长因子和激素 已证实：各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细

43、胞的状态（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松可促进表皮细胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。 6 其它 水解乳蛋白、胶原是另外两种较好的天然培养基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解产物，呈蛋黄色粉末状，富含氨基酸。一般配制成05溶液，微酸性。胶原是从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长的作用。3.常用的培养动物细胞的培养基的种类有哪些？1天然培养基 血清：常用胎牛血清（FBS）、小牛血清（CS），一般浓度10。 鸡血浆，鸡胚浸出液：含纤维蛋白原和一

44、些营养成分 水解乳蛋白 鼠尾胶原优点：营养成分丰富，培养效果良好。缺点：成分复杂，个体差异大，来源有限2、合成培养基人工合成培养基，常用如下 (1).MEM(minimum essential medium)细胞培养基系列 (2).DMEM（Dulbeccos modified Eagle medium)细胞培养基系列(3)RPMI-1640细胞培养基系列(4).M199细胞培养基系列 (7)F-10,F-12细胞培养基系列(8) DMEM-F123、无血清培养基 4.无血清培养在实验研究中有什么特殊意义？血清在动物细胞培养中有什么作用？使用无血清培养基的优点 (1）可避免血清批次间的质量变动

45、，提高细胞培养和实验结果的准确性、重复性。（2）避免血清源性污染。（3）避免血清组分对实验研究的影响。（4）有利于体外培养细胞的分化。（5）可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。血清在动物细胞培养中的作用（1）营养 提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质。（2）提供结合蛋白，结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。 （3）提供贴壁细胞固着于适当的附着面所需的贴壁因子和伸展因子，使细胞很好地贴壁（4）保护 提供蛋白酶抑制剂，使细胞免受蛋白酶的损伤。一些细胞，如内皮细胞、

46、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。这种作用是偶然发现的，现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。（5）解毒 血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。 5.目前常用的合成培养基有哪些？有哪些优点？人工合成培养基，常用如下 (1).MEM(minimum essential medium)细胞培养基系列 (2).DMEM（Dulbeccos modified Eagle medium)细胞培养基系列(3)RPMI-1640细胞培养基系列(4).M199细胞培养基系列 (7)F-1

47、0,F-12细胞培养基系列(8) DMEM-F12优点：提供近似体内的生长环境，又便于控制和提供标准化的生存环境。6.BSS有哪些功能？常用的BSS有哪些？1、 水与平衡盐溶液 balance saline solution,BSS）： 1）培养用水:体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高。培养用水中如果含有一些杂质，即使含量极微，有时也会影响细胞的存活和生长，甚至导致细胞死亡。用金属蒸馏器制备的蒸馏水，可能会含有某些金属离子，一般不作为培养用水。配制培养用液应使用经石英蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。存放时间一般不应超过2周。 2). 平衡盐溶液：主要是由无机盐

48、、葡萄糖组成。作用：提供缓冲系统，维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定提供细胞生存所需的能量和无机离子成分。用于洗涤组织、细胞的漂洗、配制其他培养用液。几种常用的BSSRingerPBSEarleHanksD-HanksD-Hanks与Hanks的一个主要区别是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hanks常用于配制胰酶溶液。配制溶液应使用双蒸水或去离子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，应当首先溶解这些成分。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌第十二章 动物细胞与组织培养技术名词解释： 1、原代培养 原代培养(Primary Culture)：亦称初代培养，指直接从机体取出的细胞或组织进行

49、第一次培养的过程。2、传代培养 继代培养（ Secondary Culture ）：亦称传代培养，从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养. 3、接触抑制 细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。一般的正常细胞并不互相重叠于其上面而生长；但是，转化细胞或癌瘤细胞则接触抑制下降，他们互相之间可在上面或下面经过而重叠生长。4、密度抑制 细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制导致细胞分裂停止。5、细胞克隆

50、6、细胞系 7、细胞株8、动物细胞固定化培养问答题：1、 体外培养细胞有哪些类型及各自特点？在体外按照培养细胞的形态不同，主要可分为以下几类：成纤维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞 （1）成纤维细胞型：本型细胞的形态似在体内生长的成纤维细胞；形态：长梭形，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞核位于中央，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起，中有卵圆形核.生长特点：细胞一般并不紧靠相连；生长时呈放射状、漩涡状走向，细胞间间隙较大。来源：由中胚层间充质组织起源的组织.如人胚肺细胞。如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌 （2）上皮型细胞形态:扁平状，不规则。细胞贴壁后呈不规则多角形，

51、中央有扁圆形核，细胞彼此紧密相连成单层细胞，呈现“铺路石状”。生长特点: 易相连成片相靠紧密相连成薄层铺石状 生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少脱离细胞群单独行动。来源:内胚层和外胚层。如皮肤、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮细胞，血管内皮细胞等。Hela细胞呈现为典型的上皮细胞型。 （3）游走型细胞： 不常见，具有类似巨噬细胞样的特征。本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。如单核巨噬细胞系统

52、的细胞中的颗粒型白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。 （4）多形型细胞：形态上不规则的细胞，不常见，一般分胞体和胞突两部分，胞突细长形类似丝状伪足；胞体略呈多角形，但较规则。如神经组织细胞如神经元、神经胶质细胞等。非贴附型细胞悬浮型细胞：指细胞在体外培养时不必贴壁，可在培养液中悬浮生长。 见于少数特殊的细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、杂交瘤细胞转化细胞系、某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。形态特点：胞体始终为球形。优点：生存空间大，培养效率高，利于大量生产，与培养基充分接触无需消化传代，易于收获细胞。缺点:不如贴附生长型观察方便，而且并非所有的培养细胞都

53、能悬浮生长;纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离。贴壁细胞经悬浮适应后也可以长期悬浮培养3、兼性贴壁细胞实际情况下，所培养的细胞并不一定呈现某种典型的形态，能影响细胞形态的因素很多，在不同培养条件下可以互相转变，细胞形态学特征仅是对培养物判断或识别的一种参考性指标，如果想明确某一培养物的确切类型，必须借助于更为特异的鉴定方法。2.体外培养的细胞需要什么样的条件？1、恒定的温度:37 2、pH：最适为7.27.4 3、气体 需要O2、CO2 （95%空气、5% CO2）二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值.4、营养：要求高，需要氨

54、基酸、维生素、辅酶、核酸、激素、生长因子等。5、无菌2、 细胞系的生长过程包括哪些主要阶段？每一生长阶段各有什么特征？(1)原代培养（初代培养）特点：这个阶段细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛；原代细胞培养通常为异质性(2)传代期特点:细胞增殖旺盛，在细胞整个生命期中此期的持续时间最长， 一般情况下，可传代1050代； 反复传代可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化；能维持二倍体核型，被称为二倍体核型；细胞应在初代或传代早期冻存为好；十代内冻存。(3)衰退期 此期细胞虽仍存活，但增殖很慢或基本停止，细胞形态轮廓增强，进而细胞发生衰退、死亡。3、 每代细胞的生长曲线包括哪几个主要时期？各期细胞有什

55、么特点？潜伏期2）指数生长期细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验研究。持续35天。 细胞生长增殖状况可以细胞群体倍增时间及细胞分裂指数等来判断。在此阶段，若细胞处于理想的培养条件，将不断生长繁殖，细胞数量日渐增加。细胞将接触而连成一片，渐次铺满培养器皿底物，提供细胞生长的区域逐渐减少甚至消失。因接触抑制而细胞运动停止、密度抑制而细胞终止分裂。细胞不再繁殖而进入平台期。3生长停滞期。特点：细胞虽已停止生长，但仍存在代谢活动并可继续存活一定的时间。若及时分离培养、进行传代，将细胞分开接种至新的培养器皿并补充以新鲜培养液，细胞将于培养器皿中成为下一代的细胞而再次繁殖。否则细胞因中毒而发生死亡。4、衰亡期 达到稳定生长期的细胞群体，由于生长环境的继续恶化和营养物质的短缺，群体中细胞死亡率逐渐上升，以致细胞死亡数超过新生细胞数，群体中活细胞数下降。4、 动物细胞原代培养的方法？举例说明培养的基本过程。悬滴培养法 旋转管培养法 灌注小室培养法 培养瓶培养方法 培养板培养法 克隆培养法5、 贴壁细胞传代时采用何种方法，其技术关键是什么？6、 为保证好的冻存复苏效果，需要考虑那些问题？慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。在细胞冻存时