结合3D打印技术构建聚己内酯-骨细胞外基质复合支架及体外骨诱导性能

1、www.CRTER.org杨鹏，等. 结合3D打印技术构建聚己内酯-骨细胞外基质复合支架及体外骨诱导性能结合3D打印技术构建聚己内酯-骨细胞外基质复合支架及体外骨诱导性能杨 鹏，李淳德(北京大学第一医院骨科，北京市 100034)引用本文：杨鹏，李淳德. 结合3D打印技术构建聚己内酯-骨细胞外基质复合支架及体外骨诱导性能J.中国组织工程研究，2016，20(52):7773-7780.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.52.003 ORCID: 0000-0002-5500-344X(李淳德)文章快速阅读：聚己内酯-骨细胞外基质复合支架的体外骨诱导性杨鹏，男

2、，1988年生，山东省潍坊市人，汉族，博士，主要从事脊柱外科研究。通讯作者：李淳德，主任医师，教授，北京大学第一医院骨科，北京市 100034中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)52-07773-08稿件接受：2016-09-23结果表明：(1)3D细胞-支架共培养方式可以获得带有细胞外基质的复合支架；(2)该复合支架具备更好的成骨诱导性能。分组：(1)将216枚3D打印聚己内酯支架分为A组(与96孔板，n=72)；(2)B组(与48孔板匹配，n=144)。第1轮三维培养：(1)将第5代SD大鼠骨髓间充质干细胞种于两组支架上，接种1，2，3周；(2)A组进

3、行茜素红染色、Masson染色，B组进行胶原、糖胺多糖检测。第2轮三维培养：(1)将第1轮三维培养1，2，3周的支架进行脱细胞处理，分别记为AE1、AE2、AE3、BE1、BE2、BE3，将第5代SD大鼠骨髓间充质干细胞再次接种于6组支架上；(2)接种1，2，3周，AE1、AE2、AE3组进行茜素红染色；(3)BE1、BE2、BE3组进行钙定量、碱性磷酸酶活性及DNA定量分分析文题释义：聚己内酯：具有良好的生物相容性、生物降解性、力学性能、药物通过性及易加工等特点，并且该材料在体内降解之后的产物对机体没有毒害作用，已被广泛应用于组织工程生物材料领域，但由于聚己内酯表面缺乏细胞亲和位点且降解速度

4、较慢，因此其临床应用受到一定限制。骨细胞外基质：是由骨细胞合成并分泌到胞外，形成分布于细胞表面和细胞之间的复杂网状结构，它支撑并连接了骨骼的整体结构，并是动物体内骨细胞生长、分化、代谢的场所。摘要背景：骨组织工程学者们仍在寻找理想的骨组织工程支架，3D打印技术为支架的构建提供了新的方法，同时骨细胞外基质在成骨诱导中的作用也越来越受到关注。目的：采用3D细胞-支架共培养的方式获取聚己内酯-骨细胞外基质复合支架，检测其成骨性能。方法：将216枚3D打印聚己内酯支架分为A组(与96孔板匹配，n=72)、B组(与48孔板匹配，n=144)。第1轮三维培养：将第5代SD大鼠骨髓间充质干细胞分别接种于两组

5、支架上，接种1，2，3周，A组进行茜素红染色、Masson染色，B组进行胶原、糖胺多糖检测；第2轮三维培养：将第1轮三维培养1，2，3周的支架进行脱细胞处理，分别记为AE1、AE2、AE3、BE1、BE2、BE3，将第5代SD大鼠骨髓间充质干细胞再次接种于6组支架上，接种1，2，3周，AE1、AE2、AE3组进行茜素红染色，BE1、BE2、BE3组进行钙定量、碱性磷酸酶活性及DNA定量分分析。结果与结论：Masson染色及糖胺多糖、羟脯氨酸定量分析结果提示，随着培养时间延长，复合支架表面的细胞外基质成分逐渐增加；碱性磷酸酶活性检测结果提示，聚己内酯-骨细胞外基质复合支架的细胞成骨分化程度显著高

6、于普通聚己内酯支架(P < 0.05)；茜素红染色分析及钙定量分析结果提示，复合支架的矿化程度显著高于普通聚己内酯支架(P < 0.05)，复合支架的DNA总量相对于普通样本并没有显著升高；结果表明，通过3D细胞-支架共培养的方式可以获得带有细胞外基质的复合支架，该复合支架具备更好的成骨诱导性能。关键词：生物材料；骨生物材料；聚己内酯；支架；碱性磷酸酶；茜素红；羟脯氨酸；糖胺聚糖主题词：细胞外基质；干细胞；组织工程3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Construction of a polycaprolactone/bone extr

7、acellular matrix scaffold with three-dimensional printing technology and its osteoinductivity in vitroYang Peng, Li Chun-de (Department of Orthopaedics, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China)AbstractBACKGROUND: Scholars are still looking for ideal bone tissue-engineered scaffolds,

8、and three-dimensional (3D) printing technology is a novel construction method. In the meanwhile, bone extracellular matrix is becoming a hotspot in osteogenic induction. OBJECTIVE: To construct the polycaprolactone/bone extracellular matrix scaffold using 3D printing technology and co-culture method

9、, and to detect its osteogenic property.METHODS: 216 3D-printed polycaprolactone scaffolds were divided into group A (96 pores, n=72) and group B(48 pores, n=144). Passage 5 bone marrow mesenchymal stem cells from Sprague-Dawley rats were seeded onto the two kinds of polycaprolactone scaffolds, and

10、the group A was used for alizarin red staining and Masson staining, while the group B for collagen and glycosaminoglycan detection at 1, 2 and 3 weeks of incubation. Afterwards, the scaffolds at 1, 2 and 3 weeks of culture were decellularized and labeled as groups AE1, AE2, AE3, BE1, BE2 and BE3. Th

11、en passage 5 bone marrow mesenchymal stem cells from Sprague-Dawley rats were seeded onto each scaffold again, and the former three groups underwent alizarin red staining, and the latter three were used for calcium, alkaline phosphatase activity and DNA quantitative analysis at 1, 2 and 3 weeks of c

12、ulture.RESULTS AND CONCLUSION: Masson staining, glycosaminoglycan and hydroxyproline quantitative analysis showed that the extracellular matrix on the composite scaffold increased with time. Alkaline phosphatase activity revealed that the composite scaffold had a significantly stronger osteogenic di

13、fferentiation than the normal polycaprolactone scaffold (P < 0.05). Alizarin red staining and calcium quantitative analysis showed that the mineralization of the composite scaffold was more obvious than that of the normal polycaprolactone scaffold (P < 0.05), but the total DNA analysis did not

14、 differ significantly between scaffolds. These results suggest that the composite scaffold with extracellular matrix is constructed successfully using the 3D technology and co-culture method and exhibits a better osteoinductivity.Subject headings: Extracellular Matrix; Stem Cells; Tissue Engineering

15、Cite this article: Yang P, Li CD. Construction of a polycaprolactone/bone extracellular matrix scaffold with three-dimensional printing technology and its osteoinductivity in vitro. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(52):7773-7780.Yang Peng, M.D., Department of Orthopaedics, Peking University

16、First Hospital, Beijing 100034, ChinaCorresponding author:Li Chun-de, Chief physician, Professor, Department of Orthopaedics, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China7777ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction骨组织工程支架为种子细胞提供了停泊、生长、繁殖及代谢的场所，理想的骨组织工程细胞支架需要具备的条件为：生物相容性、

17、骨诱导性、合适的孔径和孔隙率、一定的强度及可塑性。目前骨组织工程学的研究者们仍致力于寻找一种理想的支架材料，以往研究发现，骨髓间充质干细胞在2D及3D培养过程中均能够分泌细胞外基质，这些细胞外基质的成分能够促进骨髓间充质干细胞的分化及增殖，因此骨组织工程研究者们也逐渐把目光投向利用细胞外基质构建的复合支架上。3D打印技术由美国麻省理工大学Sachs等1发明于20世纪90年代，目前3D打印技术作为一种新兴的组织工程支架制造技术备受关注，3D打印技术在骨组织工程学中应用的优势在于其高度的精确性，材料无污染性2-3，因此可以构建错综复杂的三维仿生结构。目前支架制作中已涉及到的3D打印技术主要有直接3

18、D印刷技术、熔融层积技术、光固化快速成型技术及激光烧结技术等。实验参照国内外文献报道，选用较为便捷的熔融层积技术制作聚己内酯支架，节省了支架制作成本，同时保留了支架的高度精确性和均一性，同时尝试利用3D打印聚己内酯支架培养骨髓间充质干细胞的方式，获取人工合成材料与细胞外基质组成的复合支架，去除了支架本身结构差异对实验结果的影响，通过成骨相关指标检测复合支架的成骨诱导性能，进一步观察细胞外基质的成骨诱导作用。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 细胞学水平，对比观察实验。1.2 时间及地点 实验于2015年6月至2016年3月在北京大学第一医院中心实验室完成。

19、1.3 材料 实验动物：6-8周龄SPF级雄性SD大鼠10只，体质量350-400 g，由北医维通利华实验动物中心提供，许可证号：SCXK(京)2012-0001号。聚己内酯支架：由美国Biotek公司提供3D打印技术制作的聚己内酯支架216枚，其中96孔板匹配支架72枚(A组)，48孔板匹配支架144枚(B组)，支架孔径300 m，孔隙率大于90%，A组支架细胞生长面积约2.2 cm2，B组支架细胞生长面积约7.7 cm2。试剂及仪器：倒置显微镜(CKX，OLYMPUS公司，日本)；扫描电镜S-3400N(HITACHI，日本)；超低温冰箱(MDF-U53V，SANYO，日本)；电子天平(F

20、A2104N，HANGPING，中国)；台式高速冷冻离心机(5417R，Eppendorf，德国)；HHS型电热恒温水浴锅(XMTD-204，上海博迅，中国)；SterilGARD超净工作台(BAKER，美国)；CO2恒温孵育箱(THERMO公司，美国)；分光光度计(NanoDrop 2000，Thermo scientific，美国)；成骨诱导培养液、茜素红染液(赛业生物科技有限公司，中国)；Masson染色试剂盒(凯基生物，中国)；碱性磷酸酶活性检测试剂盒、钙定量分析试剂盒、羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)；糖胺多糖检测试剂盒(Genmed，美国)。1.4 实验方法1.4

21、.1 种子细胞获取 腹腔麻醉处死大鼠，体积分数75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在含1%青链霉素的PBS中。将装有股骨及胫骨的离心管置于紫外线下消毒 30 min后移至超净台，倒掉PBS后，再用含1%青链霉素的PBS清洗股骨及胫骨3遍。去掉股骨及胫骨两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5 mL一次性注射器吸取约 5.2 mL的干细胞完全培养液，反复冲洗骨髓腔，将冲洗后的细胞培养液移至T75培养瓶中。48 h后半量更换细胞培养液。以后每2 d全量更换新鲜培养液，13比例传代至第5代，作为种子细胞进行支架种植。采用流式细胞仪鉴定干细胞。1.4.2 细胞与聚已内酯

22、支架3D培养(第1轮3D培养) 将第5代骨髓间充质干细胞配成浓度为20×109 L-1的细胞悬液，种植到聚己内酯支架中心，A组 20 L/支架，B组70 L/支架。将种植完种子细胞的聚己内酯支架放入37 、体积分数5%CO2细胞培养箱中预培养3 h。加入细胞培养液，A组180 L/孔，B组300 L/孔，每天全量更换成骨诱导培养液，诱导时长3周。培养过程中，A组支架状态良好，B组支架分别于成骨诱导第2周出现2枚支架污染，第3周出现3枚支架污染。每周从A组样本取3枚行茜素红染色，3枚行Masson染色；B组样本中取3枚行胶原检测(检测羟脯氨酸含量，并按照羟脯氨酸胶原=110比例换算为胶

23、原含量)、3枚行糖胺多糖定量分析，以评估细胞外基质生成情况，每周取3枚样本行钙定量分析。1.4.3 细胞-支架样本脱细胞处理 分别于第1轮3D培养第1，2，3周进行脱细胞处理，脱细胞过程严格遵循无菌操作，于A组每批洗脱样本中取3枚，行扫描电镜检查，扫描电镜检测由北京大学第一医院电镜中心完成，DNA总量分析由协和洛奇临床检验所协助完成；对B组样本的细胞洗脱液行碱性磷酸酶活性检测及DNA总量分析，评估细胞成骨分化及分裂增殖情况。样本放入含0.5% Trixton100 1 mL的离心管内。Vortex震荡10 min。将离心管放入-80 冰箱冷冻处理30 min，冷冻结束后将离心管即刻放入水浴箱，

24、37 水浴30 min。重复冻融操作3次。经上述步骤获得的脱细胞支架，按脱细胞处理时间分为AE1、AE2、AE3、BE1、BE2、BE3共6组。AE1为96孔板匹配聚己内酯支架与细胞培养1周后脱细胞所得复合支架，AE2为96孔板匹配聚己内酯支架与细胞培养2周后脱细胞所得复合支架，AE3为96孔板匹配聚己内酯支架与细胞培养3周后脱细胞所得复合支架，BE1为48孔板匹配聚己内酯支架与细胞培养1周后脱细胞所得复合支架，BE2为48孔板匹配聚己内酯支架与细胞培养2周后脱细胞所得复合支架，BE3为48孔板匹配聚己内酯支架与细胞培养3周后脱细胞所得复合支架。最终可用于第2轮3D培养的聚己内酯-骨细胞外基质

25、复合支架共计166枚，其中A组54枚，B组112枚，按支架洗脱时间分为6组：AE1(18枚)，AE2(18枚)，AE3(18枚)，BE1(39枚)，BE2(38枚)，BE3(35枚)。1.4.4 干细胞+复合支架共培养(第2轮3D培养) 于所得复合支架上再次种植第5代SD大鼠骨髓间充质干细胞(培养过程中再次出现污染支架7枚，其中AE1组3枚，AE3组2枚，BE3组2枚)，AE1-3组支架-细胞复合样本分别于1，2，3周分批行茜素红染色分析，BE1-3组支架-细胞复合样本于第1，2，3周分别取3枚行钙定量分析，余支架分批行脱细胞处理，同样对细胞洗脱液行碱性磷酸酶活性及DNA定量分析检测。实验过程

26、中所有污染支架排除出实验组。1.5 主要观察指标 羟脯氨酸定量及糖胺多糖定量、碱性磷酸酶活性、钙定量、DNA定量、扫描电镜分析、茜素红及Masson染色结果。1.6 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件进行分析，图表采用GrahPad Prism6.0软件制作；采用配对样本t检验对所得数据进行前后对比，P < 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 种子细胞传代及成骨分化鉴定 采用T75培养瓶于汇合度达到85%-90%时传代，传代比例为13，传代至第5代以光学显微镜观察细胞形态呈长梭形，贴壁状态良好(图1A)，茜素红染色结果见图1B，C。干细胞表面分子流式细胞

27、仪分析结果见图2。2.2 细胞外基质检测2.2.1 2D及3D培养骨髓间充质干细胞 Masson染色结果 见图3。第5代骨髓间充质干细胞贴壁后以完全培养基培养96 h后行Masson染色，细胞核呈蓝紫色，细胞与细胞之间可见大量绿染的胶原纤维，证明2D培养状态下骨髓间充质干细胞贴壁后，能够分泌胶原蛋白等细胞外基质成分。聚己内酯支架-细胞样本Masson染色可见细胞核呈蓝紫色，细胞排列有序，细胞之间可见大量绿染的胶原纤维存在，证实了3D培养过程中细胞能够分泌大量细胞外基质成分。由于支架为3D结构，倒置相差显微镜无法将支架纤维全貌拍摄清晰。2.2.2 扫描电镜观察结果 见图4。A组脱细胞样本扫描电镜

28、结果显示，第1轮3D培养样本经脱细胞处理后支架纤维表面被覆沉积物，沉积物的量随培养时间延长逐渐增加，尤以BE3组支架表面沉积物显著，但电镜没有发现显著的钙化结节，支架纤维之间可见桥状纤维结构形成。结合定量实验证实，支架纤维并表面沉积物为细胞外基质成分。糖胺多糖及羟脯氨酸定量分析结果见图5。2.3 成骨检测指标结果2.3.1 茜素红染色结果 见图6。为观察成骨钙化情况，对A组两个阶段培养所得样本行茜素红染色分析，结果显示经历相同培养时间的复合支架样本较普通聚己内酯支架样本的桔红色沉积更为显著，其中AE3组最为明显。2.3.2 碱性磷酸酶活性检测结果 见图7。BE1组碱性磷酸酶活性与聚己内酯支架组

29、比较差异无显著性意义，BE2组、BE3组碱性磷酸酶活性值均较聚己内酯支架组显著升高(P < 0.05，P < 0.01)。BE2组与BE3组培养第1周碱性磷酸酶活性比较差异无显著性意义，BE3组培养第2，3周碱性磷酸酶活性值显著高于BE2组(P < 0.01)。碱性磷酸酶活性为成骨早期的检测指标，由此可证实，随着复合支架表面沉积的细胞外基质量及成熟度提高，复合支架的成骨诱导性能逐渐提高，但骨髓间充质干细胞分化成为成骨细胞的过程中，碱性磷酸酶活性变化趋势应为先升高后降低，但研究中没有出现该趋势变化，认为这是由于诱导时间短，骨髓间充质干细胞的成骨分化未达到最高峰导致。2.3.3

30、钙定量分析结果 见图8。钙定量为成骨分化的后期检测指标，各组样本钙定量分析绝对值结果显示，BE3培养1周组、BE3培养2周组、BE2培养3周组及BE3培养3周组显著高于所有聚己内酯支架组样本(P < 0.05)，而由于聚己内酯支架培养1周组及BE1培养1周组钙含量过低，无法进行准确测量，因此研究中BE1组样本相对于普通聚己内酯支架样本钙含量差别未进行详细数据分析。钙定量作为成骨检测的晚期指标，由此可证实，随着复合支架表面沉积的细胞外基质量及成熟度提高，复合支架的成骨诱导性能逐渐提高，但研究过程中并未观察到钙定量的峰值。各组样本钙定量分析相对值(以聚己内酯支架1周组=0 g，聚己内酯支架2

31、周组2=8.95 g，聚己内酯支架3周组=16.78 g作为基础钙含量，以BE1、BE2、BE3各组支架样本的钙含量绝对值减去相应的基础钙含量值所得数据进行分析)结果显示，BE3培养2周组、BE2培养3周组及BE3培养3周组显著高于普通聚己内酯支架样本(P < 0.05)，BE3培养1周组样本的相对钙含量值与聚己内酯支架培养3周3组无显著差异；直方图分析结果可见，BE2培养2周组样本的相对钙含量值显著低于BE2培养1周组，这可能是由于统计中将1周组样本的基础值(BP1)设为0 g(含量过低，无法精确测定)，而聚己内酯支架培养1周组的实际钙含量大于0 g所致。2.3.4 DNA总量分析结果

32、 见图9。采用DNA总量分析的方法检测细胞增殖情况，最终结果显示，各组样本的DNA总量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，这可能是由于成骨诱导液对细胞增殖的移植作用导致，另一方面，种植细胞的密度高，使得细胞之间产生了接触抑制也可能细胞增殖受限的原因之一。3 讨论 Discussion骨组织工程学通过将多孔形态的三维支架与骨髓间充质干细胞或成骨细胞、成骨诱导因子整合在一起，模拟骨生长的微环境，从而达到刺激骨生成的目的，Hench将其产物称为第3代骨替代物4。成骨微环境是细胞、细胞外基质、成骨诱导因子相互作用的复杂整体。骨组织工程学的理念是通过尽可能理想化的模拟成骨微环境来制作骨骼替代

33、物，从而达到修复骨缺损，促进骨再生的目的。支架材料及种子细胞的选择在骨组织工程中尤为重要。通常认为骨折愈合的过程是由多种干细胞共同参与完成的，这些干细胞可以来源于骨髓、骨膜、周边软组织，甚至离骨折区域更远的部位5，其中骨髓间充质干细胞在骨折愈合中的作用越来越受到重视。Colnot5通过静脉注射的方式将骨髓间充质干细胞植入大鼠骨折模型中，生物发光检测发现，骨折后第3天就可以在骨髓及骨内膜检测到骨髓间充质干细胞存在。骨髓间充质干细胞目前被作为种子细胞广泛应用于骨组织工程学研究中。骨髓间充质干细胞的供体适宜选取年轻、活力强的个体，因为这类个体的干细胞往往增殖活性更强，且具备更优秀的分化潜能。研究选用

34、了体质量350-400 g、周龄6-8周龄大鼠作为骨髓间充质干细胞的供体，传代过程中估测细胞倍增时间约48 h，增殖状态良好。但当研究中提取的骨髓间充质干细胞传代至第10代后，细胞的老化现象严重，茜素红染色及碱性磷酸酶染色显示其成骨分化能力也显著下降，因此作者认为随着骨髓间充质干细胞传代次数增加，其增殖能力及成骨分化能力逐渐下降。Sachs等1利用大鼠骨髓间充质干细胞作为跟腱组织工程体系的种子细胞，选取了体质量200 g左右的SD大鼠作为种子细胞供体，实验中种子细胞状态良好。结合以往的研究，作者认为研究中选取的大鼠周龄、体质量仍偏大，选取体质量300 g以下、4周龄以下的大鼠可能会获取增殖、分

35、化活性更佳的骨髓间充质干细胞。研究采用了聚己内酯作为支架的制作，聚己内酯因具有良好的生物相容性、生物降解性、力学性能、药物通过性及易加工等特点，并且该材料在体内降解之后的产物对机体没有毒害作用，已被广泛应用于组织工程生物材料领域，但由于聚己内酯表面缺乏细胞亲和位点且降解速度较慢，因此其临床应用受到一定限制6。理想的骨组织工程支架应当是3D结构，同时具备良好的骨诱导性，这样可促进组织的血管化及新骨生成7。Hollister8提出的支架材料4F准则包含性能诉求和功能诉求。性能诉求是指支架必须具备充足的力学性能，可在组织完成修复前满足日常活动的需求；功能诉求是指支架材料能够通过释放生长因子和提供合适

36、环境来促进组织再生。随着复合支架材料的研究进展，骨细胞外基质的作用越来越受到关注。骨细胞外基质是由骨细胞合成并分泌到胞外，形成分布于细胞表面和细胞之间的复杂网状结构，它支撑并连接了骨骼的整体结构，并是动物体内骨细胞生长、分化、代谢的场所。骨母细胞接受环境产生的刺激信号后开始迁移、增殖并分化成为成骨细胞，成骨细胞最初的功能就是分泌骨细胞外基质，随后这些细胞外基质逐渐矿化以形成新骨。骨细胞外基质在调节成骨细胞的分化及活性中有着十分重要的作用，它的蛋白组成主要包括胶原蛋白和糖蛋白9，前者主要包括型胶原和很少量的型胶原；后者是由糖胺聚糖包裹一个核心蛋白分子组成，这种结构在骨组织中随处可见。组织来源的细

37、胞外基质可直接作为优良的天然骨性支架应用到骨组织工程中，但其来源受限，而且具备一定的免疫原性，因此一些骨组织工程研究者对这类细胞外基质支架的临床应用持怀疑态度。而利用直接由自体细胞分泌合成的细胞外基质则更符合骨组织工程学的理念。2005年Datta等10研究发现，利用Ti金属和骨髓间充质干细胞衍生的细胞外基质构建的骨组织工程支架具备良好的骨诱导能力，在相同的培养时长及培养条件下，Ti-细胞外基质支架上培养的细胞表达的碱性磷酸酶活性显著高于普通Ti支架组，而钙定量分析结果也显示，Ti-细胞外基质支架组的矿化情况显著优于普通Ti支架组。2010年，Liao等11利用大鼠骨髓间充质干细胞体外动态灌注

38、培养制作出了聚己内酯-细胞外基质复合支架，研究利用了相似的方法，利用3D打印技术将支架设计为孔径更加开阔、孔隙率更高的支架，使得培养基更加容易渗透支架内部环境，从而有利于细胞的新陈代谢。研究中利用扫描电镜观察不同实验时间点支架纤维表面的变化，结果提示，随着诱导培养时间的延长，支架纤维表面的沉积物逐渐增多，羟脯氨酸和糖胺聚糖定量分析结果提示，支架纤维表面的沉积物为胶原、糖蛋白等细胞外基质成分。研究结果与Liao等11学者的结果是一致的，研究中均证实3D环境下，随着培养时间的延长，骨髓间充质干细胞能够分泌更多的细胞外基质。但与其有所区别的是，在实验中采用的培养方式是3D静态细胞培养，以往研究认为，

39、动态培养过程中的液体剪切力，能够促进骨髓间充质干细胞的成骨分化及细胞外基质的分泌，因此，去除了液体剪切力会使得骨髓间充质干细胞衍生的细胞外基质成分减少，为促进骨髓间充质干细胞分泌细胞外基质，作者将骨髓间充质干细胞的种植密度由通常的 25 000-40 000个/cm2提高到200 000个/cm2，并且将更换培养液的频率调整为12 h/次，但在实验中测得的细胞外基质含量仍低于动态培养研究中报道的数据。为检测细胞外基质复合支架的骨诱导能力，再次将7781ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH图1 SD大鼠骨髓间充质干细胞培养与分化Figure 1 Cu

40、lture and identification of bone marrow mesenchymal stem cells from Sprague-Dawley rats图注：图中A为传代至第5代细胞，呈长梭形，贴壁状态良好；B、C为成骨诱导14 d后行茜素红染色，可见大量红染的矿化结节。 ABC图 大鼠骨髓间充质干细胞的表面分子流式细胞仪分析结果Figure 2 The flow cytometry analysis results of the surface markers of Sprague-Dawley rat bone marrow mesenchymal stem cell

41、s图注：图中A为CD90-APC分析结果，阳性细胞95.9%；B为CD29-FITC 分析结果，阳性细胞92.8%；C为CD45-Per CP分析结果，阳性细胞3.78%。50 m 图3 骨髓间充质干细胞2D与3D培养Masson染色结果Figure 3 Massion staining of bone marrow mesenchymal stem cells after two- and three-dimensional culture图注：图中A为3D培养7 d后(×100，标尺100 m)；B为3D培养14 d后(×100，标尺100 m)；C为3D培养21 d后

42、(×100，标尺100 m)；D为3D培养21 d后(×200，标尺100 m)；E为2D培养96 h后(×400，标尺50 m)。圈内示胶原纤维。图4 电镜观察聚己内酯支架与聚己内酯-骨细胞外基质复合支架Figure 4 Morphology of the polycaprolactone scaffold and polycaprolactone/bone extracellular matrix scaffold under electron microscope图注：图中A为培养1周后脱细胞获得的聚己内酯-骨细胞外基质复合支架纤维表面(电镜，×5

43、50)；B 为培养2周脱细胞获得的聚己内酯-骨细胞外基质复合支架纤维表面(电镜，×650)；C为培养3周后脱细胞获得的聚己内酯-骨细胞外基质复合支架纤维表面(电镜，×550)；D为聚己内酯支架(电镜，×100)；E为聚己内酯-骨细胞外基质复合支架扫描电镜结果(×110)。ABCDEABCDEABC×100 ×100 ×400 骨髓间充质干细胞以同样的密度种植到复合支架上，并且利用成骨诱导培养液在完全相同的培养条件下进行诱导培养，在培养结束后，进行样本碱性磷酸酶活性检测、钙定量分析及茜素红染色，并与普通聚己内酯支架组的数据及染

44、色结果进行比对。选取碱性磷酸酶活性及钙定量分析分别作为成骨早期及后期的定量分析指标，实验中没有探测到碱性磷酸酶活性的峰值。但在 Liao等11的研究中，碱性磷酸酶活性值在PE4组(普通聚己内酯支架组培养4 d后脱细胞所得细胞外基质复合支架)已比普通聚己内酯表现出了明显的升高，而在研究中，BE1组碱性磷酸酶活性值与普通聚己内酯支架并未表现出显著统计学差异，这可能与动态培养所得的细胞外基质产量及成熟度更高有关。钙定量分析及茜素红染色的结果也进一步证实了细胞外基质的骨诱导作用，在整个实验过程中，并未出现细胞外基质产量及成熟度的峰值，结合文献分析，认为通过延长培养时间、采用持续动态灌注培养等方式，能够

45、进一步促进骨细胞外基质的分泌及成熟。羟脯氨酸糖胺多糖1.00.20864201周2周3周碱性磷酸酶(金氏单位/g)151050细胞外基质成分定量分析(g)细胞外基质成分定量分析(g)baaaa1 2 3 1 2 3A B C D图7 不同支架与骨髓间充质干细胞共培养不同时间点的碱性磷酸酶活性Figure 7 Alkaline phosphatase activity of bone marrow mesenchymal stem cells co-cultured with different scaffolds at different time points图注：图中A为

46、聚己内酯支架，B为培养1周后脱细胞获得的聚己内酯-骨细胞外基质支架，C为培养2周脱细胞获得的聚己内酯-骨细胞外基质支架，D为培养3周脱细胞获得的聚己内酯-骨细胞外基质支架。与聚己内酯支架比较，aP < 0.05；与其他组比较，bP < 0.05。 图5 骨髓间充质干细胞-聚己内酯复合支架中细胞外基质成分定量分析Figure 5 Quantitative analysis of extracellular matrix components in the polycaprolactone/bone marrow mesenchymal stem cells scaffold图注：1为

47、复合培养1周的复合支架，2为复合培养2周的复合支架，3为复合培养3周的复合支架。 骨髓间充质干细胞-聚已内酯复合支架脱细胞脱细胞脱细胞脱细胞1周2周3周2 0001 5001 0005000聚己内酯支架 培养1周后 培养2周后 培养3周后DNA总量分析(g)经历1周共培养经历2周共培养经历3周共培养A B C D图9 不同支架与骨髓间充质干细胞共培养不同时间点的DNA总量检测结果Figure 9 Total DNA quantitative analysis results of bone marrow mesenchymal stem cells co-cultured with diffe

48、rent scaffolds at different time points图注：图中A为聚己内酯支架，B为培养1周后脱细胞获得的聚己内酯-骨细胞外基质支架，C为培养2周脱细胞获得的聚己内酯-骨细胞外基质，D为培养3周脱细胞获得的聚己内酯-骨细胞外基质支架。 图6 显微镜下不同支架与骨髓间充质干细胞复合培养结果(茜素红染色，×100)Figure 6 Different scaffolds co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells under microscope (alizarin red staining, x100

49、)图注：经历相同培养时间的复合支架较普通聚己内酯支架的桔红色沉积更为显著。 BAabcd403020100P < 0.051周2周3周6040200钙定量分析(g)P < 0.05a钙定量分析(g)aaa1周 2周 3周a b c d图8 不同支架与骨髓间充质干细胞共培养不同时间点的钙定量分析结果Figure 8 Calcium quantitative analysis results of bone marrow mesenchymal stem cells co-cultured with different scaffolds at different time point

50、s图注：图中A为绝对值，B为相对值。a为聚己内酯支架，b为培养1周后脱细胞获得的聚己内酯-骨细胞外基质支架，c为培养2周脱细胞获得的聚己内酯-骨细胞外基质，d为培养3周脱细胞获得的聚己内酯-骨细胞外基质支架。与聚己内酯支架比较，aP<0.05。 Liao等11在研究中利用DNA总量测定的方式估算细胞计数，发现普通聚己内酯支架组的DNA总量在4-8 d时间段内呈现上升趋势，培养至第8天的DNA总量超过其他所有样本，而细胞外基质复合支架组培养至16 d后，各组之间的DNA总量没有显著统计学差异。作者采用同样的方法来评估骨髓间充质干细胞增殖的情况，结果提示各组间DNA总量没有显著统计学差异，但

51、认为由此不能得出细胞外基质不具备促细胞增殖作用的结论，考虑这是由于成骨诱导培养条件下细胞的增殖受到抑制，同时在研究中，为获取足量的细胞外基质成分，将骨髓间充质干细胞的种植密度提高为200 000个/cm2，使得细胞之间产生了接触抑制，进一步限制了细胞的分裂增殖。研究存在一些不足之处。首先，研究采用的聚己内酯支架孔径均为300 m，没有设立不同孔径及孔隙率的支架进行对比，因此无法观察孔径及孔隙率变化对细胞外基质产量及成熟度的影响；其次，采用的是体外3D培养的方式，并没有进行相应的体内实验，因此细胞外基质复合支架的骨重建性能需要体内实验进一步证实，作者认为可以利用大鼠的颅骨缺损模型完善体内实验；第

52、三，研究中支架-细胞共培养的时长设定为3周，相对于骨髓间充质干细胞成骨分化的需要时间而言相对较短，因此在培养过程中，碱性磷酸酶活性并没有观察到峰值，同时钙定量分析及茜素红染色的结果均提示矿化结节的生成量偏低，这一点可以通过延长培养时间弥补，但由于静态培养过程中代谢产物沉积及培养液成分消耗等因素存在，样本感染的风险可能会升高，同时已经有研究证实，骨髓间充质干细胞诱导时间过长会导致细胞恶性变，这些都需要研究者保持警惕；第四，细胞外基质复合支架的成骨诱导性能虽然在研究中得到了证实，但作为对照组的聚己内酯支架本身就不具备骨诱导性能，由于受到实验经费及时间的限制，并没有设立具备不同骨诱导性能的支架组作为对照。这些均可以在以后的研究中进一步完善。致谢：感谢北京大学第一医院中心实验室、北京大学第一医院电镜室在细胞培养及实验结果测定中给予的技术支持与帮助。作者贡献：实验设计及实施为杨鹏，实验指导为李淳德教授，通讯作者李淳德教授负责审校。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对实验动物的处置符合2009年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审