绪论-植物组织培养

1、第一章第一章 绪论绪论第二节第二节 植物组织培养植物组织培养发展简史；植物组织培养在农业发展简史；植物组织培养在农业生产生产 上上的的应用应用第一节第一节 植物组织培养的概念及植物组织培养的概念及类型类型 主要内容：主要内容：植物组织培养含义植物组织培养含义组织培养的类型组织培养的类型植物组织培养的发展简史植物组织培养的发展简史植物组织培养在农业上的应用植物组织培养在农业上的应用A Glimpse of Plant Tissue Culture一、基本概念一、基本概念 What Is Tissue Culture?What Is Tissue Culture? Or Or in vitroin

2、 vitro culture? culture? Or micropropagation? Or micropropagation?第一节第一节 植物组织培养的概念植物组织培养的概念和类型和类型营养器官：根、茎、叶、花、形成层营养器官：根、茎、叶、花、形成层生殖器官：花药、胚珠、胚、胚乳生殖器官：花药、胚珠、胚、胚乳植物组织培养（植物组织培养（Tissue culture） 用用无菌无菌方法使植物体的离体方法使植物体的离体（in vitro)in vitro)器官、组织和细胞器官、组织和细胞在在人为提供的条件人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也下生长和发育的所有培养技术的总称，也

3、称之为离体培养（称之为离体培养（In vitro cultureIn vitro culture）或试管培养。）或试管培养。细胞：原生质体细胞：原生质体Characteristics of Characteristics of Plant Tissue Culture TechniquesPlant Tissue Culture Techniques培养条件可以人为控制培养条件可以人为控制生长周期短，繁殖率高生长周期短，繁殖率高植物组织培养特点植物组织培养特点管理方便，利于工厂化生产和自动化控制管理方便，利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养的理论基础植物组织培养的理论基础细胞全能性细胞全能性

4、 细胞细胞全能性全能性（cell totipotency) ：植物体的每一个具有：植物体的每一个具有完整结构完整结构的的细胞都具有该物种全部细胞都具有该物种全部遗传物质遗传物质，在一定条件下具有发，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。育成完整植物体的潜在能力。植物细胞全能性的表达植物细胞全能性的表达 脱分化（脱分化（dedifferentiation)：将已分化的功能细胞，放在培养将已分化的功能细胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为基上培养后，细胞重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。分生状态的过程叫脱分化。 一个细胞一旦沿着某一条

5、特定的途径分化发育后，一般不会一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发育后，一般不会再回复到未分化状态，但在组织培养条件下，可能发生脱分化再回复到未分化状态，但在组织培养条件下，可能发生脱分化和再分化。和再分化。l 再分化（再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程。的过程。植植物物全全能能性性的的表表达达离体的植物器官、离体的植物器官、组织、细胞组织、细胞 游离单细胞游离单细胞或原生质体或原生质体胚状体胚状体根、芽根、芽 愈愈伤伤

6、组组织织 人人工工种种子子再生植株再生植株 脱分化脱分化再分化再分化再分化再分化脱分化脱分化愈愈伤伤组组织织再分化再分化根根芽芽再再生生植植株株植物组织培养过程植物组织培养过程合适的外植体合适的外植体离体的植物器官、组织、离体的植物器官、组织、细胞细胞移栽移栽 外植体：外植体：由活体植物体上切取下来的，用于组织培由活体植物体上切取下来的，用于组织培养的各种接种材料。包括各种器官、组织、细胞、养的各种接种材料。包括各种器官、组织、细胞、原生质体等。原生质体等。即能被诱导产生无性增殖系的器官或即能被诱导产生无性增殖系的器官或组织。组织。胡胡萝萝卜卜离离体体根根愈伤组织：愈伤组织：在人工培养基上由外

7、植体形成的一团无序在人工培养基上由外植体形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。生长状态的薄壁细胞。指经组织培养产生的可传代的指经组织培养产生的可传代的未分化细胞。未分化细胞。组织培养植株再生的途径组织培养植株再生的途径魔芋胚状体魔芋胚状体1）、体细胞胚胎发生途径）、体细胞胚胎发生途径（胚状体发生途径）（胚状体发生途径） ： 在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5 5个时期），形成个时期），形成具有具有双极性双极性的胚状结构，而发育成

8、再生植株的途径。的胚状结构，而发育成再生植株的途径。胚状体发生途径胚状体发生途径外植体外植体愈伤组织愈伤组织胚状体胚状体再生植株再生植株再再分分化化脱分化脱分化 2）、愈伤组织途径愈伤组织途径 将将外植体接种在人工培养基上，由于植物生长调节剂外植体接种在人工培养基上，由于植物生长调节剂的存在的存在，细胞，细胞脱分化形成愈伤组织，然后通过再分化形成脱分化形成愈伤组织，然后通过再分化形成再生植株。它是最为常见的。再生植株。它是最为常见的。 原球茎原球茎-主要是兰科植物在诱导时，分化出的原初植物形态，具有主要是兰科植物在诱导时，分化出的原初植物形态，具有完整的完整的植株器官原基，植株器官原基，成苗成

9、苗容易。容易。 胚状体胚状体-由愈伤组织或表面形成的许多类似胚的突起，是初步分化的幼小由愈伤组织或表面形成的许多类似胚的突起，是初步分化的幼小生命体，芽根有共同的维管束，是双极性结构，起源于单细胞，无嵌合现象，生命体，芽根有共同的维管束，是双极性结构，起源于单细胞，无嵌合现象，结构完整，可直接形成小植株，成苗率高，去分化难，再分化也很难。结构完整，可直接形成小植株，成苗率高，去分化难，再分化也很难。 由愈伤组织或外植体诱导形成芽、根，获得由愈伤组织或外植体诱导形成芽、根，获得再生植株的方法。再生植株的方法。百百合合鳞鳞叶叶培培养养愈伤组织愈伤组织芽分化芽分化再生苗再生苗胚状体胚状体小小麦麦愈伤

10、组织发生途径愈伤组织发生途径愈伤组织愈伤组织外植体外植体愈伤组织愈伤组织芽芽根根再生植株再生植株脱分化脱分化再分化再分化高生长素高生长素(2,4-D)高高(生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素)低低(生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素)植株发生途径植株发生途径按培养材料按培养材料分为：分为：悬浮细胞培养悬浮细胞培养单细胞培养单细胞培养胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的培养幼果的培养二、二、 植物组织培养的类型植物组织培养的类型细细 胞胞 培培 养养原生质体培养原生质体培养器器 官官 培培 养养烟烟 草草器官培养：器官培养： 将植物的器官如将植物的器

11、官如胚、胚乳、珠心、胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、子房、根、茎、叶、花和幼果的叶、花和幼果的部分组织接种在部分组织接种在无菌培养基上进无菌培养基上进行培养。行培养。细胞细胞和原生质体培和原生质体培养养： 细胞培养是将植细胞培养是将植物的单个细胞分离出物的单个细胞分离出来，并进行来，并进行培养；培养；原生质体培养原生质体培养是指将是指将植物细胞的细胞壁通植物细胞的细胞壁通过机械、物理或化学过机械、物理或化学的方法去除，然后再的方法去除，然后再进行培养。进行培养。根据培养方式：根据培养方式：固体培养、液体培养固体培养、液体培养 固体培养固体培养：将培养物放在含有琼脂等固化剂的培养基表面进行培养。：

12、将培养物放在含有琼脂等固化剂的培养基表面进行培养。 液体培养液体培养：将培养物放在未加固化剂的培养基内培养，一般需进行震荡，又称液体：将培养物放在未加固化剂的培养基内培养，一般需进行震荡，又称液体 震荡培养。震荡培养。固体培养固体培养液体培养液体培养固体固体培养法培养法 是是最常用的方法。该方法简单，易行，但最常用的方法。该方法简单，易行，但养分吸收不养分吸收不均，生长速度不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。均衡，并常有褐化中毒现象发生。液体液体培养法培养法 由于由于液体中氧气含量较少，液体中氧气含量较少，常用震荡培养常用震荡培养的方法以确保氧气的供给的方法以确保氧气的供给 往复式往

13、复式摇床或旋转式摇床进行培养，速度一般为摇床或旋转式摇床进行培养，速度一般为50-200r50-200rminmin，这，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。 固体培养、液体培养的特点：固体培养、液体培养的特点：l根据培养物量的多少：根据培养物量的多少： 大量培养、微量培养大量培养、微量培养。l根据培养过程中是否需光：根据培养过程中是否需光： 光培养、暗培养光培养、暗培养l根据培养方法的不同：根据培养方法的不同： 平板培养、微室培养、悬浮培养平板培养、微室培养、悬浮培养 按培养过程分为按培养过程分为: 初代培养和继代

14、培养初代培养和继代培养初代培养（初代培养（Primary culture）：）： 指外植体的最初培养。指外植体的最初培养。继代培养（继代培养（Subculture）：）： 将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中，这种反复多次移将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中，这种反复多次移植的培养，称为继代培养。植的培养，称为继代培养。 第二节第二节 植物组织培养技术的发展历史植物组织培养技术的发展历史 1、 早期探索阶段早期探索阶段 （1930年以前）年以前） 1893年，年，Schwann和和Scheiden提出细胞学说及植物细胞全能性理论。提出细胞学说及植物细胞全能性理论。 1902年，德国植

15、物生理学家年，德国植物生理学家Haberlandt第一次尝试采用植物组织培养技术对小野芝麻、风第一次尝试采用植物组织培养技术对小野芝麻、风眼兰叶肉组织及万年青属植物的表皮细胞进行培养，但未能培养成活。眼兰叶肉组织及万年青属植物的表皮细胞进行培养，但未能培养成活。 1904年，年，Hanning首次对十字花科的萝卜和辣根的胚培养成功。首次对十字花科的萝卜和辣根的胚培养成功。 1922年，年，Knudson将兰花种子在离体的条件下非共生萌发。同年，将兰花种子在离体的条件下非共生萌发。同年，Knotte和和Robbins对离体对离体根尖进行了培养。根尖进行了培养。Robbins还对豌豆、玉米及棉花的

16、茎尖进行了培养，只形成一些缺绿的叶和根。还对豌豆、玉米及棉花的茎尖进行了培养，只形成一些缺绿的叶和根。 1925年，年，Laibach利用胚培养技术对亚麻的种间杂种胚进行了培养，并于利用胚培养技术对亚麻的种间杂种胚进行了培养，并于1929年利用亚麻的年利用亚麻的胚培养来克服杂交不亲和性。胚培养来克服杂交不亲和性。2、植物组织培养技术的初步形成（、植物组织培养技术的初步形成（1930-1960年）年） 1933年，我国植物生理学家李继侗培养银杏胚胎，并发现银杏胚乳提取液可促进离体胚的生年，我国植物生理学家李继侗培养银杏胚胎，并发现银杏胚乳提取液可促进离体胚的生长。长。 1937年，年，White

17、发现发现B族维生素族维生素对离体根培养的重要性。并指出对离体根培养的重要性。并指出IAA对植物生长发育的控制起对植物生长发育的控制起重要作用。重要作用。 1937、1938年，年，Gantheret在培养基中加入上述生长因子，使得柳树形成层诱导形成的在培养基中加入上述生长因子，使得柳树形成层诱导形成的愈伤组愈伤组织织连续生长。连续生长。Nobecomt对烟草种间杂种茎段的形成层细胞培养也得到了类似的结果。对烟草种间杂种茎段的形成层细胞培养也得到了类似的结果。 1948年，年，Skoog等通过对烟草茎段和髓培养发现，不定芽和不定根的发生由等通过对烟草茎段和髓培养发现，不定芽和不定根的发生由生长素

18、生长素/腺嘌呤腺嘌呤的的比例决定。比例决定。 1950年，年，Ball从红杉愈伤组织培养中再生获得器官。从红杉愈伤组织培养中再生获得器官。1952年年，Morel和和Martin通过通过分生组织分生组织培养获得大丽花的脱毒植株，同年，首次应用微型嫁接技培养获得大丽花的脱毒植株，同年，首次应用微型嫁接技术。术。1953年，年，Tuleche首次从花粉培养中获得银杏的首次从花粉培养中获得银杏的单倍体愈伤组织单倍体愈伤组织。1955年，年，Miller等发现了一种促进细胞分裂的植物激素等发现了一种促进细胞分裂的植物激素激动素，后来发现激动素，后来发现激动素激动素可用来代替腺可用来代替腺嘌呤促进芽的形

19、成，而且其效力比后者高嘌呤促进芽的形成，而且其效力比后者高3万倍。万倍。1957年年，Skoog和和Miller发现改变细胞分裂素发现改变细胞分裂素/生长素比例，可以控制根和芽的发生。生长素比例，可以控制根和芽的发生。1958年年，Maheshwari和和Rangaswamy从柑橘胚珠的珠心组织培养中再生获得体细胞胚；同年，从柑橘胚珠的珠心组织培养中再生获得体细胞胚；同年，Reinert 和和Steward分别从胡萝卜的愈伤组织和细胞培养中再生得到原胚，为以后的组织培养中分别从胡萝卜的愈伤组织和细胞培养中再生得到原胚，为以后的组织培养中器官发生和体细胞胚胎发生奠定了基础，也为植物细胞全能性理论

20、提供了证据。器官发生和体细胞胚胎发生奠定了基础，也为植物细胞全能性理论提供了证据。3、植物组织培养技术的发展（、植物组织培养技术的发展（1960年以后）年以后）1960年，年，Morel利用兰花茎尖培养对兰花进行利用兰花茎尖培养对兰花进行营养繁殖营养繁殖； 1962年，年，Murashige和和Skoog开发出最著名的开发出最著名的Murashige和和Skoog培养基（培养基（MS基本培养基基本培养基），并被），并被后来广泛采用的基本培养基。后来广泛采用的基本培养基。1964年，印度人年，印度人Guha和和Maheshwari利用曼陀罗利用曼陀罗花粉培养获得第一例单倍体植株花粉培养获得第一例

21、单倍体植株。从而开辟了单。从而开辟了单倍体育种技术。倍体育种技术。1971年年，Takebe等获得第一例等获得第一例原生质体培养原生质体培养的再生植株。的再生植株。1972年，年，Carlson等利用等利用原生质体融合原生质体融合在两个烟草属中进行种间杂交。在两个烟草属中进行种间杂交。1974年年，Murashige等利用细胞分裂素诱导茎尖侧芽分枝。等利用细胞分裂素诱导茎尖侧芽分枝。Zaenen和和Larebeke分别发现分别发现土壤农杆土壤农杆菌（菌（Agribacterium）中的根瘤诱导的主要成分是中的根瘤诱导的主要成分是Ti质粒质粒。1978年年，Melchers等进行了番茄和马铃薯的

22、等进行了番茄和马铃薯的体细胞杂交体细胞杂交。1979年年，Marton提出了利用植物提出了利用植物原生质体和土壤农杆菌共培养原生质体和土壤农杆菌共培养的方法进行转化。的方法进行转化。1981年，年，Larkin和和Scowcroft引入引入“体细胞无性系变异体细胞无性系变异（Somaclonal variation）”这一术语。这一术语。1982年年，Krens等的工作证明，等的工作证明，原生质体可以摄入裸露的原生质体可以摄入裸露的DNA，表明可以用外源，表明可以用外源DNA对原生质体对原生质体进行遗传转化。进行遗传转化。1982年，年，Zimmermann利用利用电刺激进行原生质体融合电刺激

23、进行原生质体融合。1985年年，Horsch等用等用土壤农杆菌对叶盘进行感染和转化土壤农杆菌对叶盘进行感染和转化，并得到再生的转化植株。，并得到再生的转化植株。植物组织培养技术的发展特点植物组织培养技术的发展特点q研究材料范围逐步扩大研究材料范围逐步扩大q培养方法逐步完善培养方法逐步完善q培养基不断改进培养基不断改进q实验手段逐步完备实验手段逐步完备植物再生植株的途径植物再生植株的途径第三节第三节 植物组织培养的应用植物组织培养的应用领域领域1、快速繁殖、快速繁殖2、种苗脱毒、种苗脱毒3、远缘杂交、远缘杂交8、植物性药物和生物制品的生产植物性药物和生物制品的生产7、基因工程、基因工程 6、种质

24、保存、种质保存4、突变育种、突变育种5、单倍体育种、单倍体育种一、植物快速繁殖一、植物快速繁殖植物快速繁殖技术是植物组织培养技术的一个重植物快速繁殖技术是植物组织培养技术的一个重要组成部分，在生产中起的作用最大，应用也最要组成部分，在生产中起的作用最大，应用也最广泛。广泛。加速育种加速育种提高物种优良性状提高物种优良性状工厂化生产工厂化生产大量快速繁殖大量快速繁殖植物的有性繁殖周期长，数量较少，一粒种子发植物的有性繁殖周期长，数量较少，一粒种子发育成一株新植株。而运用快速无性繁殖技术可在短期内育成一株新植株。而运用快速无性繁殖技术可在短期内获得大量遗传性一致的植株，如石刁柏一个腋芽半年可获得大

25、量遗传性一致的植株，如石刁柏一个腋芽半年可以繁殖以繁殖1200倍，一株的腋芽一年可繁殖倍，一株的腋芽一年可繁殖7万株。万株。传统的的无性繁殖方法如扦插、分根、压条、嫁接等方传统的的无性繁殖方法如扦插、分根、压条、嫁接等方法法 ，繁殖系数低、速度慢，不能适应现代化生产要求，繁殖系数低、速度慢，不能适应现代化生产要求，但快速无性繁殖技术周期短、速度快、效率高但快速无性繁殖技术周期短、速度快、效率高 ，在植物，在植物优良品种的快速繁殖及推广方面取得了巨大成功。优良品种的快速繁殖及推广方面取得了巨大成功。同时可用于珍稀植物的快速繁殖，抢救与繁殖珍、稀、同时可用于珍稀植物的快速繁殖，抢救与繁殖珍、稀、濒

26、危植物，比如红豆杉。濒危植物，比如红豆杉。脱毒快速繁殖技术脱毒快速繁殖技术 现已发现的植物病毒有现已发现的植物病毒有500多种，一些植物病毒相当严多种，一些植物病毒相当严重，给生产造成极大损失，如葡萄扇叶病毒。使葡萄减产重，给生产造成极大损失，如葡萄扇叶病毒。使葡萄减产10%50%，花卉病毒使各种花卉严重退化，致使花少而小，花卉病毒使各种花卉严重退化，致使花少而小，甚至造成畸变和变色。利用组织培养脱毒后所得到的无毒甚至造成畸变和变色。利用组织培养脱毒后所得到的无毒植株，形状明显优于原来染病植株。植株，形状明显优于原来染病植株。 l 大规模生产大规模生产农作物：甘蔗、甘薯、马铃薯农作物：甘蔗、甘

27、薯、马铃薯果树：葡萄、果树：葡萄、柑橘柑橘、苹果、桃、苹果、桃花卉：花卉：菊花菊花、香石竹、蝴蝶兰、香石竹、蝴蝶兰苗木：苗木：桂花桂花、银杏、银杏药材：太白七药、药材：太白七药、红豆杉红豆杉、紫草、人参、紫草、人参 甘蔗茎尖快速繁殖甘蔗茎尖快速繁殖l甘蔗脱毒苗与常规苗相比，果蔗甘蔗脱毒苗与常规苗相比，果蔗增产增产33.6%69.4%，糖料蔗蔗茎，糖料蔗蔗茎增产增产15.1%52.1%、蔗糖分提高、蔗糖分提高0.12%1.71%(绝对值绝对值)。 柑橘的快速繁殖（非试管苗）柑橘的快速繁殖（非试管苗）l桔子传统都是以嫁接的方式进行繁殖桔子传统都是以嫁接的方式进行繁殖,其其成苗需要成苗需要1-2年的

28、时间才能成苗年的时间才能成苗,繁殖速繁殖速度非常的慢度非常的慢,而采用植物非试管快繁技而采用植物非试管快繁技术术 ，采其一个，采其一个枝段枝段,在智能化控制的在智能化控制的快快繁苗床给其创造最佳的生根环境繁苗床给其创造最佳的生根环境,就能快就能快速的生根成苗速的生根成苗 。l选择幼小的桔树选择幼小的桔树,取粗壮的取粗壮的枝条枝条作为离体作为离体材料材料,一般取材长度为一般取材长度为5厘米厘米,下切口靠芽下切口靠芽带一定斜度斜剪带一定斜度斜剪,再用快繁宝处理再用快繁宝处理,处理处理后繁殖于智能化控制的快繁苗床后繁殖于智能化控制的快繁苗床, 能快能快速的生根速的生根 。菊花快速繁殖菊花快速繁殖l菊

29、花组织培养，菊花组织培养，茎尖茎尖是主要是主要培养部位，其它还可采用培养部位，其它还可采用茎茎段、花托、花瓣、叶片段、花托、花瓣、叶片等。等。用于快速繁殖、加快繁殖速用于快速繁殖、加快繁殖速度的，可采用大于度的，可采用大于1厘米以上厘米以上的茎段。如培养的茎段。如培养脱毒苗脱毒苗，则，则以采用小于以采用小于0.6厘米的茎尖培厘米的茎尖培养，有较好的脱毒效果。养，有较好的脱毒效果。 桂花快速繁殖桂花快速繁殖根据当年的气候特点结合桂根据当年的气候特点结合桂花的生长物候期特点确定花的生长物候期特点确定萌发芽萌发芽的取材时间，一般在每年的的取材时间，一般在每年的23月份；对金桂萌发芽消毒，消月份；对金

30、桂萌发芽消毒，消毒时间控制在毒时间控制在37min，以茎尖，以茎尖作为培养对象能够获得高达作为培养对象能够获得高达86.1的诱导率。的诱导率。 红豆杉快速繁殖红豆杉快速繁殖使用茎和枝条诱使用茎和枝条诱导愈伤组织，导愈伤组织，也可利用芽、叶也可利用芽、叶和成熟种子胚。和成熟种子胚。1. 单倍体单倍体的概念及其特点的概念及其特点 含含有一套染色体组的生物体；有一套染色体组的生物体； 被子植物的配子体世代。被子植物的配子体世代。矮小性矮小性不育性不育性全显性。全显性。单倍体植物的直接利用；单倍体植物的直接利用；克服杂种分离，缩短育种年限；克服杂种分离，缩短育种年限；快速获得异花授粉植物的自交系；快速

31、获得异花授粉植物的自交系；单倍体植物的诱变育种；单倍体植物的诱变育种；克服远缘杂种不孕性与不稳定的现象；克服远缘杂种不孕性与不稳定的现象；（1）单倍体材料的获得）单倍体材料的获得 单倍体育种的首要问题是如何获得大量的单倍体植株。据现单倍体育种的首要问题是如何获得大量的单倍体植株。据现有的研究材料，用花药培养产生单倍体植株有两个途径有的研究材料，用花药培养产生单倍体植株有两个途径: 第一是在离体培养的花药中，花粉经过类似胚胎发育的过程第一是在离体培养的花药中，花粉经过类似胚胎发育的过程直接形成单倍体植物，如烟草、曼陀罗等。直接形成单倍体植物，如烟草、曼陀罗等。 第二是在离体培养的花药中，花粉形成

32、愈伤组织，再从愈伤第二是在离体培养的花药中，花粉形成愈伤组织，再从愈伤组织分化出单倍体植株。组织分化出单倍体植株。（2）花药的接种）花药的接种接种前的准备工作接种前的准备工作 接种和培养花药是在无菌条件下进行的，所用的一切用具必须接种和培养花药是在无菌条件下进行的，所用的一切用具必须彻底灭菌。彻底灭菌。花粉发育时期的鉴定花粉发育时期的鉴定 适宜的花粉发育时期对于提高花粉诱导愈伤组织分化的频率是适宜的花粉发育时期对于提高花粉诱导愈伤组织分化的频率是很重要的，为此，进行花药培养前，要用显微镜进行很重要的，为此，进行花药培养前，要用显微镜进行花粉发育时期花粉发育时期的鉴定。的鉴定。 经显微镜检查后，

33、把花粉细胞的经显微镜检查后，把花粉细胞的发育进程与发育进程与花药或花序的外部花药或花序的外部形态联系形态联系起来，按照起来，按照花粉花粉单核期单核期或单核期的花蕾或花序的外部形态或单核期的花蕾或花序的外部形态标志选取花药进行接种培养。标志选取花药进行接种培养。 诱导诱导愈伤组织分化出根、茎、愈伤组织分化出根、茎、叶的方法是在叶的方法是在愈伤组织长到愈伤组织长到1-3毫毫米大小（如小米大）时，即可转移到诱导米大小（如小米大）时，即可转移到诱导分化分化培养基上，促使分化培养基上，促使分化长出植株。一般说来，愈伤组织如果先形成芽，随后根自然会发生，长出植株。一般说来，愈伤组织如果先形成芽，随后根自然

34、会发生，如果先有根，以后不一定会出芽。因此，掌握芽分化的条件是十分如果先有根，以后不一定会出芽。因此，掌握芽分化的条件是十分重要的。重要的。 愈伤组织愈伤组织转移培养工作是在无菌室或接种箱内进行的，转移后愈转移培养工作是在无菌室或接种箱内进行的，转移后愈伤组织培养在伤组织培养在23-28恒温室内，每日光照恒温室内，每日光照9-11小时，可用日光灯作小时，可用日光灯作辅助光，光强度在辅助光，光强度在2000勒克斯以上。勒克斯以上。 在在转移愈伤组织时，应注意其极性，原来向上转移愈伤组织时，应注意其极性，原来向上的转移后仍的转移后仍应向上，应向上，否则会影响生长，同时在转移时否则会影响生长，同时在

35、转移时，避免，避免沾带过多的培养基。沾带过多的培养基。 处理方式：处理方式：l试管内进行；试管内进行；l花粉植株定植后进行；花粉植株定植后进行；药剂处理；药剂处理；植株鉴定。植株鉴定。 三、原生质体培养与体细胞杂交三、原生质体培养与体细胞杂交 杂交育种由于亲缘关系远的物种间存在杂交不结实。杂交育种由于亲缘关系远的物种间存在杂交不结实。按照植物细胞全能性理论及植物组织培养的方法，利用按照植物细胞全能性理论及植物组织培养的方法，利用物种间的体细胞融合、杂种细胞的组织培养，通过这种物种间的体细胞融合、杂种细胞的组织培养，通过这种技术克服远缘杂交的不亲和性。技术克服远缘杂交的不亲和性。1.原生质体的概

36、念原生质体的概念 植物细胞原生质体是指那些去除全部细胞壁的细胞。植物细胞原生质体是指那些去除全部细胞壁的细胞。 此时，细胞外仅由细胞膜包裹，此时，细胞外仅由细胞膜包裹， 呈圆形只有在高渗溶液中才呈圆形只有在高渗溶液中才能相对稳定。能相对稳定。 原生质体经适当处理，可与其他细胞融合成新的体细胞。原生质体经适当处理，可与其他细胞融合成新的体细胞。比完整的细胞更容易获得外来遗传物质，为实现异源遗比完整的细胞更容易获得外来遗传物质，为实现异源遗传物质转化提供了较好的实验材料。传物质转化提供了较好的实验材料。原生质体在一定条件下可以融合成杂种细胞，开辟了一原生质体在一定条件下可以融合成杂种细胞，开辟了一

37、条新的育种途径。条新的育种途径。1892， J. A. Klerker 用机械法获得原生质体；用机械法获得原生质体；1960，E.C. Cocking 用酶法首先从番茄根尖中分离出大量有活性的原用酶法首先从番茄根尖中分离出大量有活性的原生质体并通过培养再生出细胞壁，形成再生植株生质体并通过培养再生出细胞壁，形成再生植株;1960，G. Barski发现细胞原生质体能融合在一起形成单核的、并能进发现细胞原生质体能融合在一起形成单核的、并能进行分裂的杂种细胞；行分裂的杂种细胞；1972，P.S.Carlon首次获得烟草体细胞种间杂种。首次获得烟草体细胞种间杂种。80年代年代 ，此项技术在我国得到发

38、展。，此项技术在我国得到发展。4. 原生质体的制备原生质体的制备（1）取材与灭菌）取材与灭菌（2）酶解）酶解 (纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶) （3）分离）分离 （沉淀法、漂洗法）（沉淀法、漂洗法）（4）洗涤）洗涤（5）鉴定（形态观测、活性鉴定）鉴定（形态观测、活性鉴定）原生质体的培养：原生质体的培养：细胞壁再生；细胞壁再生；细胞分裂；细胞分裂；植株再生。植株再生。5. 原生质体的融合原生质体的融合v化学法诱导融合化学法诱导融合1)按比例混合双亲原生质体按比例混合双亲原生质体- 2)滴加滴加PEG- 3)滴加高钙、高滴加高钙、高PH值溶液值溶液- 4)洗涤原生质体溶

39、液洗涤原生质体溶液- 5)离心获得原生质体溶液离心获得原生质体溶液-6)筛选杂种细胞筛选杂种细胞-7)再生杂种细胞。再生杂种细胞。v物理法诱导融合物理法诱导融合基本程序：基本程序：l原生质体的获得；原生质体的获得；l电击融合；电击融合；l筛选杂种细胞；筛选杂种细胞；l杂种细胞再生和完杂种细胞再生和完整植株的形成。整植株的形成。6. 融合细胞的培养鉴定与筛选融合细胞的培养鉴定与筛选杂种细胞的显微镜鉴别；杂种细胞的显微镜鉴别；互补法鉴定杂种细胞；互补法鉴定杂种细胞；细胞与分子生物学法；细胞与分子生物学法；植株形态的鉴别。植株形态的鉴别。（三）人工种子（三）人工种子 人工种子即人为制造的种子，它包含

40、植物胚状体、人工种子即人为制造的种子，它包含植物胚状体、营养成分、激素、其他成分。其具有种子的功能，可营养成分、激素、其他成分。其具有种子的功能，可直接用于田间播种。直接用于田间播种。 1、人工种子的构成人工种子的构成 人工种皮人工种皮 胚胚 状状 体体 人工胚乳人工胚乳2、人工种子的特点人工种子的特点：（1）可以不受环境条件的限制，周年进行生产；）可以不受环境条件的限制，周年进行生产；（2）经人工无性繁殖产生，有利于保存该种系的优良性状；）经人工无性繁殖产生，有利于保存该种系的优良性状；（3）成本低，适于田间机械化生产；）成本低，适于田间机械化生产；（4）可根据需要调节胚乳成分。）可根据需要

41、调节胚乳成分。3、人工种子的制备人工种子的制备（1）胚状体的制备及其同步生长；）胚状体的制备及其同步生长；（2）人工胚乳的制备；）人工胚乳的制备；（3）配制包埋剂及人工包埋。）配制包埋剂及人工包埋。 人工人工种子包埋示意图种子包埋示意图 4%海藻酸钠海藻酸钠 体细胞胚体细胞胚 包埋包埋丸丸 2% CaCl2 人工人工种子种子 水水 4、人工种子的贮存与萌发、人工种子的贮存与萌发 低温、干燥、洁净。低温、干燥、洁净。1、基因工程的定义 按照人们的愿望， 进行遗传物质的设计，通过体外 DNA重组技术 和DNA转移技术，有目的地改造生物性状， 使现有物种在短时间内出现新的性状， 创造出新的生物类型。

42、致癌农杆菌介导的致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法质粒载体转化法2、重组、重组DNA的直接转化法的直接转化法微粒散射技术微粒散射技术 (Particle bombardment)（二）基因工程的基本步骤1、目的基因的克隆与鉴定；2、植物表达载体的构建；3、植物的遗传转化；4、转化细胞的筛选；5、转基因植株的鉴定。基因基因基因克隆基因克隆基因转化基因转化DNA重组技术重组技术植物遗传转化技术植物遗传转化技术植物组织培养植物组织培养技术技术p抗病细胞突变体基本原理抗病细胞突变体基本原理p抗病细胞突变体筛选程序抗病细胞突变体筛选程序p抗病细胞突变体筛选实例抗病细胞突变体筛选实例六、植物六、植物抗病细胞突变体筛选抗病细胞突变体筛选基本原理基本原理l 利用利用植物组织培养过程中出现的变异，或由物理、化植物组织培养过程中出现的变异，或由物理、化学因素诱发变异，给予一定的选择压力，筛选出符合育学因素诱发变异，给予一定的选择压力，筛选出符合育种