淀粉酶的活力测定与制备 打印

1、淀粉酶的制备与活力测定Ø 基础知识淀粉酶是水解淀粉（包括糖原、糊精）中糖苷键的一类酶的统称，广泛存在于动植物和微生物中。它是研究较多、生产最早、产量最大和应用最广的一类酶。1.-淀粉酶的结构目前，已对很多不同种类和来源的-淀粉酶（黑曲霉、米根霉、人和猪胰腺、人唾液腺、大麦种子和地衣芽孢杆菌)的晶体结构进行了X-射线衍射研究，并得到了高分辨率的晶体结构图。研究表明所有-淀粉酶均为分子量在50ku左右的单体，由经典的三个区域(A、B、C)组成：中心区域A由一个(/)8圆筒构成；区域B由一个小的-折叠突出于3和3之间构成；而C-末端球型区域C则由一个Greek-key基序组成，为该酶的活性

2、部位，负责正确识别底物并与之结合。为保持-淀粉酶的结构完整性和活性，至少需要一个能与之紧密结合的Ca2+，而Cl-往往是-淀粉酶的变构激活因子，并且在所有Cl-依赖性的-淀粉酶中，组成催化三联体的残基都是严格保守的10。2.-淀粉酶的性质早在1967年，Jones 和Varner就对小麦中-淀粉酶的活性进行了研究11。不同来源的-淀粉酶的酶学和理化性质有一定的区别，它们的性质对在其工业应用中的应用影响也较大，在工业生产中要根据需要使用合适来源的酶，因此对淀粉酶性质的研究也显得比较重要。 2.1底物特异性 -淀粉酶和其它酶类一样，具有反应底物特异性，不同来源的淀粉酶反应底物也各不相同，通常-淀粉

3、酶显示出对淀粉及其衍生物有最高的特异性，这些淀粉及衍生物包括支链淀粉、直链淀粉、环糊精、糖原质和麦芽三糖等。2.2最适 pH和最适温度 反应温度和pH对酶活力影响较大，不同来源的-淀粉酶有各自的最适作用pH和最适作用温度，通常在最适作用pH和最适作用温度条件下酶相对比较稳定，在此条件下进行反应能最大程度地发挥酶活力，提高酶反应效率。因此，在工业应用中应了解不同的酶最适pH和最适温度，确定反应的最佳条件，最大限度地提高酶的使用效率是很重要的。 通常情况下-淀粉酶的最适作用pH一般在2到12之间变化。真菌和细菌类-淀粉酶的最适pH在酸性和中性范围内，如芽孢杆菌-淀粉酶的最适pH为3，碱性-淀粉酶的

4、最适pH在912。另外，温度和钙离子对一些-淀粉酶的最适pH有一定的影响，会改变其最适作用范围。不同微生物来源的仅一淀粉酶的最适作用温度存在着较大差异，其中最适作用温度最低的只有2530，而最高的能达到100130。另外，钙离子和钠离子对一些酶的最适作用温度也有一定的影响12。2.3金属离子 -淀粉酶是金属酶，很多金属离子，特别是重金属离子对其有抑制作用；另外，巯基，N-溴琥珀酸亚胺，p-羟基汞苯甲酸，碘乙酸，BSA，EDTA和EGTA等 对 仅一淀粉酶也有抑制作用。 -淀粉酶中至少包含一个Ca2+，Ca2+使酶分子保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定性。Ca2+对仅一淀粉酶的亲和能力比

5、其它离子强，其结合钙的数量在1到10之间。结晶高峰淀粉酶A(TAA)包含10个Ca2+，但只有一个结合很牢固。通常情况下结合一个Ca2+就足以使-淀粉酶很稳定。用EDTA透析或者用电渗析可以将Ca2+从淀粉酶中除去，加入Ca2+可以激活钙游离酶。用Sr2+和Mg2+代替TAA中的Ca2+，在Sr2+和Mg2+过量的情况下也能使其结晶。加入Sr2+、Mg2+和Ba2+离子可以激活用EDTA失活的TAA。通常情况下，有Ca2+存在淀粉酶的稳定性比没有时要好，但也有报道-淀粉酶在Ca2+存在时会失活，而经EDTA处理后却保留活性，另外，有报道称Ca2+对仅一淀粉酶没有影响。2.4电场强度实验结果表明

6、，不同强度电场导致酶活性增加的效应不同，并且呈非单调性变化。我们认为，不同强度电场对酶蛋白分子的构象产生了不同影响，处理酶所用的电场能量虽然不足以改变酶蛋白氨基酸序列，但可以改变酶蛋白的构象姚占全等13用不同强度电场处理-淀粉酶5min，处理后分别在第1天与第1O天测定电场对-淀粉酶活性的影响。第1天测定结果表明，电场对酶产生明显影响，而且不同强度电场对-淀粉酶活性的影响程度不同，在0.56.0kVcm范围内，酶活性随场强增加呈非单调性变化，与对照组相比，变化幅度在5.5%26.2%之间。第1O天测定，酶活性变化幅度在0.216.3%之间，表明电场对酶产生的影响经过一定时间后趋于消失。3.-淀

7、粉酶的工业应用 -淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种水解酶，其最早的商业化应用在1984年，作为治疗消化紊乱的药物辅助剂。现在，-淀粉酶已广泛应用于食品、清洁剂、啤酒酿造、酒精工业、纺织退浆和造纸工业。3.1在焙烤工业中的应用 各种酶制剂在食品工业中的应用已有上百年的历史，最近几十年-淀粉酶广泛地应用于焙烤工业中焙烤工业中使用的酶制剂有很多，如蛋白酶、脂肪酶、普鲁兰酶、木聚糖酶、纤维素酶、糖化酶等，但没有一种酶能取代-淀粉酶在焙烤食品中的应用。-淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大，纹理疏松；提高面团的发酵速度；改善面包心的组织结构，增加内部组织的柔软度；产生良好而稳定的面包

8、外表色泽；提高入炉的急胀性；抗老化，改善面包心的弹性和口感；延长面包心储存过程中的保鲜期。 面包等焙烤食品储存一定时间后逐渐变干变硬，易碎，风味变差，这些都是由于面包的陈化造成的，每年由于面包老化造成巨大的损失。传统的用于抑制老化，提高焙烤食品质地和风味的添加剂主要有化学试剂，食糖，奶粉，糖酯，卵磷脂和抗氧化剂等，近几年，酶 制剂越来越多的作为面团改良剂和抗老化剂用在焙烤工业中，包括-淀粉酶、分支酶、去分支酶、-淀粉酶和普鲁兰酶等，其中将-淀粉酶和普鲁兰酶联合使用可以有效的延迟焙烤食品陈化，提高产品的货价期。但是 ，在使用-淀粉酶时，对其加入量要求比较严格，稍微过量就会导致面包等焙烤食品粘度的

9、增加。因此，最近人们逐渐使用中温-淀粉酶，由于其最适作用温度在5070左右，所以其在淀粉糊化时具有活性，而在焙烤过程中则会逐渐失活，最终在焙烤完成时活性丧失。而且，在加工过程中-淀粉酶会水解淀粉生成聚合度在49的糊精，这些糊精也具有抗老化性。但是，现在中温-淀粉酶仅能从极少的一些微生物中提取14，15。 3.2在淀粉工业中的应用 -淀粉酶用于淀粉工业，可用来生产变性淀粉、淀粉糖等。由于-淀粉酶在适宜条件下对淀粉具有较强的水解能力，控制反应的条件，可以控制淀粉的水解率，从而将淀粉水解成多孔状的多孔淀粉。多孔淀粉可以作为微胶囊芯材和吸附剂，作为香精香料、风味物质、色素、药剂及保健食品中功能成分的吸

10、附载体，成本低，可自然降解，现已广泛应用于食品、医药、化工、农业、保健品等领域。淀粉在高温条件下发生糊化，因此生产多孔淀粉多采用中温-淀粉酶，另外，将-淀粉酶和其它淀粉酶如糖化酶、普鲁兰酶等协同使用会提高反应效率和淀粉成孔效果，因此现在多孔淀粉的研制多采用-淀粉酶和其它酶协同反应。 -淀粉酶现已广泛的应用于淀粉糖的生产，主要用于淀粉的糖化和液化，因此都采用高温酶。工业生产中，淀粉的液化是将-淀粉酶先混入淀粉乳中，加热，淀粉糊化后进行液化。由于-淀粉酶对于糊化淀粉具有很强的催化水解作用，因此可以迅速将淀粉水解成 小分子，使其粘度降低，流动性增高，以利于淀粉的糖化16。3.3在啤酒酿造中的应用 啤

11、洒是最早用酶的酿造产品之一，在啤洒酿造中添加-淀粉酶使其较快液化以取代一部分麦芽，使辅料增加，成本降低，特别在麦芽糖化力低，辅助原料使用比例较大的场合，使用-淀粉酶和-淀粉酶协同麦芽糖化，可以弥补麦芽酶系不足，增加可发酵糖含量，提高麦汁率 ，麦汁色泽降低，过滤速度加快，提高了浸出物得率，同时又缩短了整体糊化时间。啤洒酿造中糊化时添加-淀粉酶，在20世纪70年代主要用BF7658-淀粉酶；80年代用食品级枯草杆菌-淀粉酶；80年代末，我国无锡酶制剂厂首先生产出耐高温-淀粉酶，可使副原料比例从原来的30增加到40以上，实现了无麦芽糊化，节粮、节能显著，使啤酒行业的综合经济效益得到进一步提高17。

12、3.4在酒精工业中的应用 在玉米为原料生产酒精中添加-淀粉酶低温蒸煮的新工艺，每生产1t酒精可节煤 224.42kg。又可减少冷却用水，提高出酒率8.8，酒精成品质量也有显著提高。酒精生产应用耐高温-淀粉酶。采用中温95105蒸煮，既可有效地杀死原料中带来的杂菌，降低入池酸度和染菌机率，又可保护原材料中的淀粉组织不被破坏，形成焦糖或其它物质而损失，从而提高原料利用率18。3.5在纺织退浆中的应用 由于棉织物在编织过程中需使用较大的张力，容易使丝线断裂，因此需加入一些浆料对其保护。织物退浆主要使用-淀粉酶，它会使淀粉大分子发生分解，生成可溶性的水解产物，减弱了对纤维的粘附力。早期是用麦芽产生的一

13、种内生酶来退浆，近期则使用真菌或细菌淀粉酶。细菌淀粉酶尤其适用，因为它们能够耐高温，在碱性的环境里有一定的稳定性，具有一个中性的最适pH值(pH57.5)。酶的催化效率高，有利于提高生产效率。如用碱分解淀粉退浆需要l0h12h，而用-淀粉酶只要20min30min即可完成退浆过程。淀粉酶退浆的另一原因是比其它退浆剂(如酸或氧化剂)更利于环保。在退浆浴中添加钙盐，可提高淀粉酶的稳定性，从而可用较高的温度或较低的酶剂量来达到退浆的目的19。3.6在造纸中的应用 当代造纸工业中，造纸用化学品在提高纸品质量、增加纸品功能、提高生产效率和降低生产成本等方面发挥着极为重要的作用。由于淀粉与造纸用植物纤维素

14、结构相近，相互间有 良好的亲和作用，资源广泛，廉价易得，尤其是经变性处理的淀粉，能赋予纸张优异的性能，因此各类变性淀粉在造纸中广泛用于湿部添加、层间喷雾、表面施胶和涂布粘合。-淀粉酶可以生产涂布粘合用变性淀粉。 3.7在清洁剂中的应用 目前，各种酶制剂广泛地应用于现代高密度清洁剂。酶用在清洁剂中最主要的优点是它的反应条件比无酶清洁剂温和，早期的洗碟机用洗涤剂反应需要的条件比较苛刻，使用时容易对餐具造成损伤，而且它不能用于清洗精巧瓷器和木质餐具，因此清洁剂工业开始寻找条件温和，更加有效的清洁剂，而将酶制剂用于清洁剂以后，可以在较低的清洗温度下就到达很好的清洗效果。现在，几乎90以上的液体清洁剂中

15、都含有-淀粉酶,而且其在洗碟机用洗涤剂中的应用需求还在不断的增加。 4.展望 综上所述，各种-淀粉酶作为一种重要的工业用酶，已经广泛应用于淀粉及淀粉基工业中，且已经取得了很好的使用效果。对缩短生产周期，提高产品得率和原料的利用率，提高产品质量和节约粮食资源，都有着极其重要的作用。但由于不同来源-淀粉酶的性质上 的差异，导致了其应用受到一定的局限，如耐高温-淀粉酶在高温条件下才能发挥最大活力，在低温和中温时其利用效率很低，从而限制了其应用范围。另外，不同-淀粉酶应用于食品中，其安全性有的尚未完全肯定。因此，在以后的研究中，可以通过化学方法或生物方法对-淀粉酶进行改性，扩展其使用的范围，提高使用效

16、率。无论如何，随着科技的发展、研究的深入，-淀粉酶将会得到更加广泛的应用。一、实训目的学习和掌握测定淀粉酶（包括-淀粉酶和-淀粉酶）活力的原理和方法。二、实训原理淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括-淀粉-淀粉酶两种。-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。糖酸淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原

17、，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：  淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是-淀粉酶和-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。-淀粉酶不耐热，在7015min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化-淀粉酶，测出-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总

18、活力（-淀粉酶活力+-淀粉酶活力），再减去-淀粉酶的活力，就可求出-淀粉酶的活力。三、实训材料、主要仪器和试剂1实验材料  萌发的小麦种子（芽长约1cm）2仪器（1）离心机 （2）离心管 （3）研钵（4）电炉 （5）容量50mL×1, 100mL×1 （6）恒温水浴（7）20mL具塞刻度试管×13（8）试管架（9）刻度吸管2mL×3, 1mL×2, 10mL×1 （10）分光光度计3试剂（均为分析纯）  （1）标准麦芽糖溶液（1mg/m

19、L）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入。若溶液混浊可过滤后使用。（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7·H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7·2H2O29.4

20、1g，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55mL与B液145mL混匀，即为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。  四、操作步骤1、麦芽糖标注曲线的制作取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂：试剂管号1234567麦芽糖标准液（mL）00.20.61.01.41.82.0蒸馏水（mL）2.01.81.41.00.60.20麦芽糖含量（mg）00.20.61.01.41.82.03,5-二硝基水杨酸（mL）2.02.02.02.02.02.02.0摇匀，置沸水浴中

21、煮沸5min。取出后流水冷却，加馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在520nm波长下比色测定吸光度值。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。  2、淀粉酶液的制备 称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取1520min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3 000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于-淀粉酶活力测定。 吸取上述淀粉酶原液10

22、mL，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。  3.酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表2酶活力测定取样表进行操作。 酶活力测定取样表 操作项目-淀粉酶活力测定 1   2  3淀粉酶原液（mL）1.01.01.0钝化-淀粉酶置70水浴15min，冷却淀粉酶稀释（mL）0003,5二硝基水杨酸（mL）2.000预保温将各试管和淀粉溶液置于40恒温水浴中保温10min1%淀粉溶液（mL）1.01.01.0保温在40恒温水浴中准确保温5min3,5二硝基水杨酸（mL）02.02.0 取三支试

23、管。 于试管中加入酶液1ml，在70±0.5恒温水浴中确切加热15min，钝化淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。 在对照管中加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠。 在4支试管中加入pH5.6柠檬酸钠缓冲液。 将4支试管置于恒温水浴中，在40±0.5保温15min，再向各个试管中加入40下预热的1%淀粉液2ml，摇匀，立即放入40恒温水浴5min，取出后 向测定管中加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测酶。4.淀粉酶总活力测定 取酶液5ml，用蒸馏水稀释至1000ml，为稀释酶液。另取4支试管编号，2支为对照，2支为测定管。然后加入稀释酶液1ml。在对照管中加入

24、4ml 0.4mol/L氢氧化钠。4支试管中加入1mlpH5.6柠檬酸钠缓冲液。以下步骤重复-淀粉酶活力测定步的操作，同样准备测糖。五、结果计算计算- 2、- 3光密度平均值与- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下列公式计算- 淀粉酶的活力。淀粉酶活力=C×VT/（W×VS×T）式中，C为从标准曲线上差得的麦芽糖含量，mg；VT为淀粉酶原液总体积，mL；VS为反应所用淀粉酶原液体积，mL；W为样品质量，g；T为反应时间，min。六、备注（1）样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。  （2）为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达5min时取出试管，立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过±0.5。  （3）如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发1d、2d、3d