水溶性水溶性海星皂苷的分离纯化及其抗真菌活性研究

1、水溶性海星皂苷的分离纯化及其抗真菌活性研究 何颖 北京化工大学北方学院 化药1107摘要：为了分离纯化出具有强抗真茵活性的水溶性海星皂苷，以罗氏海盘车(Asteras roUeston)腕为实验材料，利用水抽提方法获得水溶性海星皂苷粗品，依次利用大孔树脂和硅胶柱层析对水溶性海星皂苷进行了纯化，并对其抗真茵活性进行了测定。研究结果发现，在30、50、70、80、95乙醇溶液的大孔树脂柱层析洗脱组分中，70乙醇溶液洗脱组分对白色念珠茵和裂殖酵母菌的抗真菌活性最强。70乙醇溶液洗脱组分经硅胶柱层析进一步纯化后，得到了SF-1、SF-2、SF-3和SF-4四种纯化样品，其中SF-I纯化样品没有抗真菌活

2、性，SF2纯化样品具有极弱的抗真茵活性，SF-3和SF-4纯化样品均具有很强的抗真菌活性。SF-3纯化样品在高压液相柱层析(HPLC)图谱中仅显示单一洗脱峰，表明其纯度很高，可应用于高效抗真菌药物的研制。研究结果为利用水溶性海星皂苷研制高效抗真菌药物奠定了基础。关键词：海星；水溶性海星皂苷；抗真菌活性；大孔树脂柱层析；硅胶柱薄层层析皂苷，又称皂甙，是一种广泛存在于植物以及海洋棘皮动物中的、具有多种药理学活性的物质。海星皂苷是海星的次生代谢产物，对纯的海星皂苷的大量试验表明它们具有多种药理活性：溶血活性、肿瘤细胞毒性、抗病毒作用、抗革兰氏阳性菌活性、阻断哺乳动物神经肌肉传导作用、Na+K+ATP

3、酶抑制作用、抗溃疡作用以及抗炎、麻醉和降血压活性等。目前，对海星皂苷的制备多采用甲醇、乙醇等稀醇提取法协3J，这种工艺方法冗长复杂、萃取率低H】，存在着有机溶剂使用量大、成本高、容易对环境造成污染等一系列缺点1；同时提取的海星皂苷水溶性比较差，应用时常需用促溶剂如DMSO等对其进行溶解，这在一定程度上影响了其抗真菌活性，也限制了其在临床医学上的应用范围。到目前为止，国内外尚未见到对水溶性海星皂苷的报道极少，更没有利用水溶性海星皂苷进行抗真菌活性的研究报道。本文利用水抽提法、大孔树脂柱层析和硅胶柱层析从罗氏海盘车(Asteras rollestoni)腕中分离并纯化出水溶性海星皂苷，筛选出具有显

4、著抗真菌活性的水溶性海星皂苷单体，为利用水溶性海星皂苷开发研制高效抗真菌药物奠定基础。1 材料与方法11材料罗氏海盘车(Asterias rollestoni)采自青岛胶州湾海域，裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)和白色念珠菌(Candida albicans)由中国海洋大学微生物工程实验室友情惠赠，采用YPD培养基(酵母浸膏O5，蛋白胨1，葡萄糖2，琼脂2)于28 cc培养；旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂，冷冻干燥机购自美国西盟(SIM)公司，AB一8型大孔树脂购自天津南开化工厂，硅胶板及层析用硅胶(200300目)购自青岛海洋化工厂，Agilentl 100

5、型高压液相柱层析(HPLC)仪、RID检测器和Agilent ZORBAXEclipse XI)BC18型HPLC层析柱(46 mm X 150 mm，05舯)为美国Agilent公司产品，HPLC层析柱洗脱流动相所用乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。12水溶性海星皂苷的分离提取取新鲜罗氏海盘车腕，用匀浆器打碎，60水浴2 h，期间不断搅拌，16层纱布过滤后收集海星水提液。将海星水提液pH调整为10，上样于预处理的AB8型大孔树脂柱(30 mm300 mm)，蒸馏水洗柱后分别用30、50、70、80、95的乙醇溶液各300 mL进行洗脱，收集各种洗脱组分，石油醚脱脂后使用正丁醇进行萃取，经旋转

6、蒸发和冷冻干燥后备用。13大孔树脂各洗脱组分抗真菌活性测定参照2005中国药典中的管碟法3进行抑菌环直径的测定。将不同水溶性海星皂苷洗脱组分的冻干品配制成质量浓度为05 mgmL的生理盐水溶液，分别测定其对裂殖酵母和白色念珠菌的抑菌环大小，测量抑菌环直径并拍照。14水溶性海星皂苷的硅胶柱层析将筛选出的具有高抗真菌活性的大孔树脂柱洗脱组分上样于硅胶常压柱(15 mm X 200 mm)，利用混合展层剂(丁醇：圪馥乙脂：=4：1：5)系统进行连续洗脱，收集洗脱组分(每管5 mL)。对各洗脱组分进行硅胶板薄层层析，合并迁移率相同的洗脱组分，经旋转蒸发和冷冻干燥后备用。15水溶性海星皂苷各纯化组分的抗

7、真菌活性测定水溶性海星皂苷纯化组分抑菌环直径的测定方法同13。硅胶柱纯化样品的最低抑菌浓度(MIC)的测定参照丛日山等(20cr7)琼脂稀释法5。16水溶性海星皂苷纯化样品的纯度鉴定称取水溶性海星皂苷纯化样品的冻干品04呜，用去离子水配制成质量浓度为05 msmE的水溶液，取20止溶液上样于Agilent ZORBAXEclipse XDB-C1B(46 inm x 150 lain，05 tun)HPLC柱，在25用流动相(V乙腈：=36：100)进行洗脱(流速为1 mlJmin)，检测203 nnl的光吸收，根据高压液相色谱确定被测组分的纯度。17数据处理全部数据均使用“平均数标准差(牙s

8、)”表示，各实验组问的数据比对均采用Excel软件进行t检验。2 结果21大孔树脂各洗脱组分抗真菌活性利用管碟法对使用30、50、70、80、95乙醇洗脱的组分进行了抗真菌活性研究，各洗脱组分对裂殖酵母菌和白色念珠菌的抑制情况如图l所示，抑菌环大小测定及其MIC值如表1所示。结果表明，质量浓度为05 memE的各洗脱组分对裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)和白色念珠菌(Candida albicans)均有一定抑制作用，但抑制程度不尽相同。其中，30的洗脱组分有较弱抗真菌活性；50、80和95的洗脱组分均具有较强的抗真菌活性；70的洗脱组分的抗真菌活性最强。22

9、70乙醇洗脱组分硅胶柱层析将具有显著抗真菌活性的70乙醇洗脱组分进行硅胶柱层析，对各硅胶柱洗脱组分进行硅胶板薄层层析检测，结果如图2显示：第910号洗脱组分均为迁移牢0，76 4-0Ol的单一斑点，合并收集为SF-I纯化样品；第17一18号洗脱组分均为迁移率0570Ol的单一斑点，合并收集为SF-2纯化样品；第2526号洗脱组分均为迁移率040001的单一斑点，合并收集为SF3纯化样品；第3435号洗脱组分均为032001的单一斑点，合并收集为SC-4纯化样品。对四种纯化样品分别进行旋转蒸发和冷冻干燥后，冷冻保存备用。A裂殖酵母菌；B白色酵母菌a30乙醇溶液洗分_b50乙醇溶液洗脱组分；c70

10、乙醇溶液洗脱组分；d。80乙醇溶液洗脱组分；e95乙醇溶液洗脱组分；各洗脱组分的使用质量浓度均为05 mmL表l各种大孔树脂柱洗脱组分对裂殖酵母菌和白色念珠菌的抑菌环大小(n=3，is)23硅胶柱层析纯化样品的抗真菌活性鉴定质量浓度为O5l-TlL的SF1、SF2、SF-3和SF-4纯化样品对裂殖酵母菌和白色念珠菌的抑菌环大小如图3所示，抑菌环大小测定及其MIC值如表2所示。在质量浓度为05唱mE的4种硅胶柱纯化样品中，SF一1纯化样品没有抗真菌活性，SF一2纯化样品具有极弱的抗真菌活性，SF3和SF-4纯化样品均具有很强的抗真菌活性。其中，sF。3和SF-4纯化样品的抗真菌活性大于SF-2纯

11、化样品(P05)。备硅胶柱洗脱组分的序号如薄层层析斑点下方的数字所示第910、1718、2526和3435号组分均为单一斑点。第910号组分的迁移率均为o762-001，合并为SF-1；第1718号组分的迁移率均为057001，合并为SF-2；第2526号的迁移率均为040001，合并为SF-3；第3435号组分的迁移率均为032 4-001。合并为sF-4A 裂殖酵母菌；B白色酵母菌aSF-1纯化样品；bsn2纯化样品；csF3纯化样品；dSF-4纯化样品24水溶性海星皂苷纯化样品SF3的高压液相(HPLC)柱层析鉴定将20吐05 mS,nL的sF3纯化样品水溶液上样于HPLC层析柱，各洗脱

12、组分(y乙腈：k=36：100)的高压液相色谱图见图4。sF3纯化样品在色谱图中仅仅显示为单一洗脱峰，面积归一化程度高达98以上。sF一3纯化样品在旋转蒸发后有结晶析出，说明水溶性海星皂苷纯化样品sF一3的纯度很高。表2各种硅胶柱纯化样品对裂殖酵母和白色念珠菌的抑菌环大小及其最低抑菌质量浓度(c)(n=3，孟s)3讨论近年来，临床上器官移植、深部外科手术、血液透析与肠外营养手段的广泛应用，致使真菌病的发病率明显升高，广谱抗菌药、免疫抑制剂、放化疗药物的使用也越来越频繁7。目前使用抗真菌药物并结合其它治疗措施，能在一定程度上控制某些真菌的感染；然而，随着抗真菌药物的过量滥用，各种真菌对抗真菌药物

13、的抗药性也在逐渐提高，且目前临床上使用的各种合成抗真菌药物均对人体有一定的毒副作用。在这种情况下，从自然界生物中提取的天然抗真菌药物，以其特效低毒的优点越来越受到人们的青睐，也成为各国学者争相研究的目标。海星皂苷不但具有抗癌、抗菌及抗炎活性，而且还具有持续降压等多种作用，是可开发为海洋药物的一种重要活性物质，应用前景十分广阔鹏。日本学者Hashimoto和Yasumoto最早发现海星的水提物中存在皂苷，并对其结构和物理化学性质进行了测定一1。学者们先后从海星纲10余种动物中分离出的皂苷样品具有抗菌活性01，并对其理化性质，溶血试验、紫外光谱和红外光谱进行了测定。目前，对海星皂苷的分离纯化主要采

14、用甲醇等机溶剂提取，利用反相硅胶柱层析和反相HPLC获得各个组分纠3，这种海星皂苷的提取方法不仅操作步骤繁琐，而且所制备的皂苷单体化合物往往水溶性较差，在实践应用时常需要添加DMSO等有机促溶剂促进溶解，有机促溶剂的添加在一定程度上限制了这在一定程度上限制了其在临床医学和工农业生产等领域的应用途径和范围bJ。由于海星皂苷的相对分子质量大，结构非常类似，多种海星皂苷及多羟基甾体皂苷常常混合存在，因此分离纯化的难度较大。至今国内外仍没有水溶性海星皂苷的分离纯化及其抗真菌活性的研究报道。为了解决这一问题，我们首次建立了利用罗氏海盘车(Asteras rollestoni)腕的水抽提液、采用60水浴的

15、方法分离制备水溶性海星皂苷的方法，并先后利用大孔树脂柱层析和硅胶柱层析对水溶性海星皂苷进行了进一步纯化，获得了具有显著抗真菌活性、成分单一的水溶性海星皂苷，纯度为98以上。对罗氏海盘车腕进行水抽提的方法，一方面可以从海星中提取到更多的水溶性海星皂苷，另一方面可以保证海星皂苷中连接在苷元上的糖链不因温度过高而发生断裂，从而最大限度地保持了海星皂苷的生物活性。此外，由于皂苷在酸性条件下极易水解只有在碱性条件下才相对稳定，因此我们将水提液的pH值调为10，以减少水溶性海星皂苷的水解。该技术方法已被袁文鹏等(2007)证实是切实有效的5f。本文采用浓度梯度乙醇洗脱的方法从罗氏海盘车腕水抽提液中分离出了

16、多种水溶性海星皂苷组分，发现在30一95乙醇溶液的大孔树脂柱层析洗脱组分中，70乙醇溶液洗脱组分对白色念珠菌和裂殖酵母菌的抗真菌活性最强。为了获得具有高抗真菌活性的水溶性海星皂苷单体组分，本文又利用硅胶柱层析对所得到的70乙醇洗脱组分进行了进一步纯化。由于在硅胶柱层析中展层剂的选择合适与否直接关系到纯化操作的成败，本文还探索了不同配比的正丁醇一异戊醇一水、正丁醇一乙醇一水、正丁醇一乙酸一水以及正丁醇一乙酸乙酯一水等不同展层剂对水溶性海星皂苷的分离条件，发现正丁醇一乙酸乙酯一水(vz丁醇：VL酸乙醇：咏=4：1：5)对海星皂苷的分离效果最好，并选用此展层剂对海星皂苷进行了硅胶柱层析纯化。通过硅胶

17、柱层析最终获得了在硅胶板薄层层析中迁移率相同且仅为单一斑点的四种纯化样品sF-1、SF2、SF一和SF-4，发现SF-3和SF_4纯化样品的抗真菌活性最强。该研究结果与袁文鹏等(2007)的研究报道是一致的吲。为了确定纯化样品的纯度，本文还对SF-3纯化样品进行了HPLC柱层析，层析结果发现sF3纯化样品在HPLC洗脱组分的色谱图中仅出现单一洗脱峰，面积归一化程度达98以上，且SF-3纯化样品在旋转蒸发后有结晶析出，从而证明水溶性海星皂苷纯化样品SF3的纯度很高，已为单体组分，可用于新型抗真菌药物的研制。本文从罗氏海盘车腕水抽提液中分离制备出水溶性海星皂苷粗品，纯化并筛选出水溶性极强且具有高抗

18、真菌活性的水溶性海星皂苷纯品，为研制新型高效海洋抗真菌药物奠定了基础。目前，正在进行SF-3单体组分抗真菌活性的广谱性以及体内外抗肿瘤活性的研究。参考文献：1 汤海峰，易杨华，张淑瑜，等海星皂苷的研究进展J中国海洋药物杂志，2004，23(12)：48572 YANG S W，CHAN T M，BUEVICH A，et a1Novel steroidal艇枷璐，Sch 725737 and Seh725739，a I饱Ine starfish，Novodna omenssJBioorg Med Chem Lett，2007，17：554355473 GIL J H，JUNG J H，KIM K J，d a1Structural determim-tion of saponins extracted from starfish by fast atom bombard-merit colllsion-induced dissociation m脚印ec舡吼11etr)rJAnal Sci，2006，22(4)：64l一6444文震，党志，宗敏华，等超临界c02萃取海星皂甙J精细化工，2006，23(7)：657-6605袁文鹏，丛日山，杨秀霞，等水溶性海参皂苷的分离纯化及其抗真菌活性研究J山东大学学报，2007，42(5)：69736国家药典委员会中华人民共