琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制（课堂PPT）

1、LOGO由PowerBar模板组提供琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 LOGOPage 2n 学习动物的处死与组织匀浆的方法。学习动物的处死与组织匀浆的方法。n 学习离心机的使用方法。学习离心机的使用方法。n 进一步理解酶的竞争抑制原理。进一步理解酶的竞争抑制原理。实验目的实验目的：LOGOPage 3实验原理：实验原理：n 竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可与底物竞竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可与底物竞争性结合酶的活性中心，抑制酶的活力。竞争性抑制剂的争性结合酶的活性中心，抑制酶的活力。竞争性抑制剂的抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例。抑制

2、程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例。n 草酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争草酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。在体内，琥珀酸脱下的在体内，琥珀酸脱下的2H 经电子传递链传递，最后与氧经电子传递链传递，最后与氧结合生成水，并释放出能量。在体外则可用甲烯蓝（蓝色）结合生成水，并释放出能量。在体外则可用甲烯蓝（蓝色）作为受氢体，甲烯蓝接受琥珀酸脱下的作为受氢体，甲烯蓝接受琥珀酸脱下的2H 而被还原为甲而被还原为甲烯白（无色）。在甲烯兰含量一定的条件下，蓝色消退的烯

3、白（无色）。在甲烯兰含量一定的条件下，蓝色消退的快慢程度可指示琥珀酸脱氢酶的活力，因此，可依据蓝色快慢程度可指示琥珀酸脱氢酶的活力，因此，可依据蓝色消退时间来判断该酶活力被抑制的程度。消退时间来判断该酶活力被抑制的程度。LOGOPage 4二、实验原理 抑制剂和底物的抑制剂和底物的结构相似结构相似，可与，可与底物底物竞争酶的活性中心竞争酶的活性中心，阻碍酶，阻碍酶- -底底物复合物的形成。物复合物的形成。抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑制剂与底物浓度的相对比例（制剂与底物浓度的相对比例（I/SI/S）LOGOPage 5HOOCCH2CH2C

4、OOHHOOCCH=CHCOOHFADFADH2MBHMBH2 2甲烯白（无色）甲烯白（无色）MB甲烯蓝（蓝色）甲烯蓝（蓝色）在在无氧条件无氧条件下，以甲烯蓝褪色时间来判断琥珀酸脱氢下，以甲烯蓝褪色时间来判断琥珀酸脱氢酶活性的改变。酶活性的改变。草酸草酸HOOCHOOCCOOHCOOHn 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶LOGOPage 6实验器材与试剂实验器材与试剂:n （一）试剂（一）试剂n pH=7.4的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液n 0.25%琥珀酸钠溶液琥珀酸钠溶液n 0.5%草酸钠溶液草酸钠溶液n 0.01%甲烯蓝溶液甲烯蓝溶液n 生理盐水生理盐水n 液体石蜡液体石蜡LOGOPage 7实验器材

5、与试剂实验器材与试剂：（二）器材（二）器材研钵研钵.手术剪手术剪.手术镊子手术镊子2mL移液管移液管1000 uL微量可调仪器微量可调仪器10mL离心管离心管低速离心机低速离心机LOGOPage 8实验操作：实验操作：n (1)肝糜液的制备肝糜液的制备n 用颈椎脱臼法处死小白鼠用颈椎脱臼法处死小白鼠n 将肝脏取出置于研钵，用生理盐水洗净，剪碎肝脏充将肝脏取出置于研钵，用生理盐水洗净，剪碎肝脏充分研磨至糊状分研磨至糊状n 分批加入磷酸缓冲液，边加边磨，总共分批加入磷酸缓冲液，边加边磨，总共7mln 搅匀后倒入圆底离心管，离心搅匀后倒入圆底离心管，离心3分钟分钟n 将上清液倒入一支试管中备用，即为

6、含有琥珀酸脱氢将上清液倒入一支试管中备用，即为含有琥珀酸脱氢酶的肝糜液酶的肝糜液LOGOPage 9实验操作：实验操作：另取中试管另取中试管5支，标号支，标号 琥珀酸脱氢酶活力的测定琥珀酸脱氢酶活力的测定编号编号123450.25%琥珀酸钠溶液/ml0.500.502.000.500.5%草酸钠溶液/ml0.500.500.502.00蒸馏水/ml2.002.001.50肝糜液/ml1.001.001.001.001.0甲烯蓝/ml0.200.200.200.200.20摇匀，静置于摇匀，静置于3737摄氏度的水浴中（此后再勿摇动）注意观察各管的颜色变化，记摄氏度的水浴中（此后再勿摇动）注意观

7、察各管的颜色变化，记录各管颜色消退的顺序和时间，分析原因，振荡褪色的反应液，观察实验现象并录各管颜色消退的顺序和时间，分析原因，振荡褪色的反应液，观察实验现象并分析产生该现象的原因。分析产生该现象的原因。LOGOPage 10n 1肝脏一定要充分研磨至糊状，一使琥珀酸脱氢肝脏一定要充分研磨至糊状，一使琥珀酸脱氢酶尽量释放到溶液里酶尽量释放到溶液里n 2离心时注意离心管一定要精确平衡，并将重要离心时注意离心管一定要精确平衡，并将重要相等的离心管对称放置相等的离心管对称放置n 3离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不要振离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不要振荡离心管，以免肝糜液重新变浑浊荡离心管，

8、以免肝糜液重新变浑浊注意事项：注意事项：LOGOPage 11思考题：思考题：n 1:为什么反应开始后，反应液必须静止，不能在为什么反应开始后，反应液必须静止，不能在摇动摇动?n 避免空气中的氧接触反应溶液，使的还原性的甲避免空气中的氧接触反应溶液，使的还原性的甲烯白重新氧化成甲烯蓝烯白重新氧化成甲烯蓝LOGOPage 12思考题：思考题：n 2:本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶？本本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶？本实验成功的关键是什么？实验成功的关键是什么？LOGOPage 13思考题：思考题：n 3：抑制剂还可以选用什么物质？：抑制剂还可以选用什么物质？n 还可以选用丙二酸还可以

9、选用丙二酸n 4：利用本实验的数据，说明酶竞争性抑制的特：利用本实验的数据，说明酶竞争性抑制的特点？点？n 竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同；位相同；c.抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；但增加底物浓度可使抑制程度减小；d.动力学参动力学参数：数：Km值增大，值增大，Vm值不变。值不变。LOGOPage 14思考题：思考题：n 5：本试验在设计上存在某些缺陷，指出存在的：本试验在设计上存在某些缺

10、陷，指出存在的缺陷与改进方案？缺陷与改进方案？LOGOPage 15补充：补充：n 琥珀酸脱氢酶（琥珀酸脱氢酶（Succinatedehydrogenase，简，简称称SDH），黄素酶类，是），黄素酶类，是线粒体内膜线粒体内膜的结合酶，的结合酶，属属膜结合酶，膜结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需需氧和产能氧和产能的呼吸链提供电子，为线粒体的一种标的呼吸链提供电子，为线粒体的一种标志酶。志酶。n 琥珀酸脱氢酶有两种，一种是以琥珀酸脱氢酶有两种，一种是以泛醌泛醌作为受作为受体的，另一

11、种是作用于所有体的，另一种是作用于所有受体受体。 LOGOPage 16n琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种 1.硫酸甲酯吩嗪（硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法）反应法 2.铁氰化钾铁氰化钾K3Fe（CN）6还原法还原法 3.TTC（氯化三苯四氮唑）法（氯化三苯四氮唑）法 4.MTT法法 5.NBT（氯化硝基四氮唑蓝）法（氯化硝基四氮唑蓝）法 LOGOPage 17n 1.硫酸甲酯吩嗪（硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法）反应法n 琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与PMS（吩嗪（吩嗪二甲酯硫酸盐），二甲酯硫酸盐）

12、，DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等发生反应催二氯酚靛酚）等发生反应催化琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光化琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光度计检测即可加以定量反映，其反应式为：光度计检测即可加以定量反映，其反应式为：SuccinatePMSFumaratePMSH2；PMSH2DCPIPPMSDCPIPH2。DCPIP呈蓝色，标准的吸收光谱在呈蓝色，标准的吸收光谱在600nm处，这处，这种色泽可因其还原而渐次变淡，从而种色泽可因其还原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变处的光密度的变化与化与DCPIP含量成正比，测定含量成正比，测定2.6-DPIP

13、的还原速度可以推算出的还原速度可以推算出SDH的活力。一分子的活力。一分子DCPIP被还原，即代表一分子琥珀酸被被还原，即代表一分子琥珀酸被氧化。故可测定此反应系统在氧化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化，来处的吸收光度变化，来计算计算SDH的活性。的活性。SDH活性计算：（标准测定）活性计算：（标准测定）/标准标准=mol/min/mg。 LOGOPage 18n 2.铁氰化钾铁氰化钾K3Fe（CN）6还原法还原法 n 以铁氰化钾以铁氰化钾K3Fe（CN）6和琥珀酸钠为底和琥珀酸钠为底物，使琥珀酸脱氢酶催化反应将铁氰化钾还原为物，使琥珀酸脱氢酶催化反应将铁氰化钾还原为亚铁氰化钾

14、亚铁氰化钾K4Fe（CN）6，K4Fe（CN）6再再与与Fe3作用生成普鲁士蓝，在作用生成普鲁士蓝，在700nm波长测定波长测定吸光值，以检测普鲁士蓝之生成量，作为琥珀酸吸光值，以检测普鲁士蓝之生成量，作为琥珀酸脱氢酶的还原力，吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶脱氢酶的还原力，吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活力愈强。活力愈强。 LOGOPage 19n 3.TTC（氯化三苯四氮唑）法（氯化三苯四氮唑）法 n 无色无色TTC（2，3，5-氯化三苯基四唑）作为氯化三苯基四唑）作为人造受氢体，它在细胞呼吸过程中接受氢，还原人造受氢体，它在细胞呼吸过程中接受氢，还原成三苯基甲膳（成三苯基甲膳（TF）。后者以红色晶

15、体的形式存）。后者以红色晶体的形式存在于细胞内，采用有机溶剂（如甲苯、乙酸乙醋在于细胞内，采用有机溶剂（如甲苯、乙酸乙醋、三氯甲烷、丙酮或乙醇等）进行萃取。萃取液、三氯甲烷、丙酮或乙醇等）进行萃取。萃取液测定测定485nm吸光度后，以吸光度后，以TTC还原量表示脱氢酶还原量表示脱氢酶活性，根据标准曲线计算活性，根据标准曲线计算TF生成量，进而求出生成量，进而求出TTC-脱氢酶活性脱氢酶活性 LOGOPage 20n 4.MTT法法 n MTT是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色，同时在细胞色素素

16、C的作用下生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的的作用下生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（甲臜（Formazana），经异丙醇作用颗粒溶解显），经异丙醇作用颗粒溶解显色。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正色。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度比，因此可根据光密度570nm处处OD值推测出活值推测出活细胞的数目。细胞的数目。 LOGOPage 21n 5.NBT（氯化硝基四氮唑蓝）法（氯化硝基四氮唑蓝）法 n NBT易溶于水，呈淡黄色，以易溶于水，呈淡黄色，以NBT为受氢体为受氢体，接受由琥珀酸钠盐被酶作用而脱下的氢，进而，接受由琥珀酸钠盐被酶作用而脱下的氢，进而形成紫蓝色

17、的沉淀，于反应体系中加入形成紫蓝色的沉淀，于反应体系中加入PMS，混，混匀，匀，37保温保温30min，之后加入，之后加入TCA终止反应。终止反应。加异丙醇溶解显色，混匀，即可于加异丙醇溶解显色，混匀，即可于548nm测测OD值。规定：值。规定：30min内内548nm下下OD值为值为1.0时的酶时的酶量为量为1个活力单位。比活力个活力单位。比活力=活力单位数活力单位数/毫克蛋白毫克蛋白。LOGOPage 22竞争性抑制的机理竞争性抑制的机理 n 竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；物；n 抑制剂与酶的结合部位（活性中心）与底物与抑制剂与酶的结合

18、部位（活性中心）与底物与酶的结合部位相同；酶的结合部位相同；n 抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；物浓度可使抑制程度减小；n 动力学参数：动力学参数：Km值增大，值增大，Vm值不变。抑制程值不变。抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例例注意：结合在酶的同一部位以及结构类似并不注意：结合在酶的同一部位以及结构类似并不是竞争性抑制的必要条件，抑制剂结合的部位阻是竞争性抑制的必要条件，抑制剂结合的部位阻碍底物和酶的结合，即产生空间位阻也可以造成碍底物和酶的结合，即产生空间位阻也可以造成竞争性抑制。竞争性抑制。 LOGOPage 23琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶n 琥珀酸脱氢酶是唯一嵌入到线粒体内膜的酶，是琥珀酸脱氢酶是唯一嵌入到线粒体内膜的酶，是线粒