感觉神经肽P物质在损伤修复中的作用及分子机制(一)

1、感觉神经肽P物质在损伤修复中的作用及分子机制一【摘要】为探讨感觉神经肽P物质SP在损伤修复中的作用，围绕感觉神经与修复进程中创面/伤口 SP代谢的关系、SP在修复细胞表达 生长因子及受体、表皮干细胞迁移、分化等方面的作用开展了研究。 研究证实感觉神经释放的SP可上调成纤维细胞表达神经肽，诱导成纤 维细胞表达生长因子及受体，调控表皮干细胞迁移、分化的作用，进 入肉芽组织内的表皮干细胞可跨胚层向血管内皮细胞和成纤维细胞分 化，提示感觉神经肽SP参与介导感觉神经调控损伤修复。【关键词】感觉神经肽损伤修复 P物质Effectofse nsory neuropeptideSP onwoun dheali

2、 ngan ditsmolecularmecha nis mAbstract:Toi nv estigatetheeffectofse nsory neuropeptidesubsta ncePSPo nwoun dheal ingan drelatedmolecularmecha nism.Theresearchwascarriedouto ntherelatio n shipbetwee nsen sory nervesa ndmetabolismofse nsory neuropeptideSP inth ewoun ds,theroleofSPi ntheexpressio no fg

3、rowthfactorsa ndthosereceptorsby repaircells,a ndparticipatio nin migrati onan ddiffere ntiatio no fepidermalstem cells.Theresultswereasfollows:SPreleasedfromse nsory nerves in ski nwounds up regulatedneuropeptideexpressionofthefibroblastcellsjnducedfibrobla stcellstoexpresssomegrowthfactorsa ndthos

4、ereceptors,playeda nimporta ntr ole in migrati onan ddiffere ntiatio no fepidermalstemcells,whichca ntran sdifferentiateintofibroblastorendothelialcellsifthestemcellsmigratedintogradurationtissue.TheresultssuggestthatSPasamediatorofsensorynerversparticipates intheregulationofwoundhealing.Keywords:se

5、nsoryneuropeptide;woundrepair;substanceP感觉神经肽为感觉神经元胞体合成的一类神经肽，包括P物质(SP)降钙素基因相关肽(CGRP)神经肽Y(NY) K物质等，其中SP与损伤修复 关系最为密切。组织损伤可刺激感觉神经末梢储存的 SP进入损伤组织， 与巨噬细胞、T淋巴细胞、肥大细胞等免疫细胞的特异受体结合，通过 刺激免疫细胞释放细胞因子，参与组织修复早期的炎症阶段的调控； SP与成纤维细胞、血管内皮细胞、角质细胞细胞相应受体结合，可促 进DNA合成和细胞增殖1。由于感觉神经末梢释放的SP受内肽酶降解，半衰期仅数分钟，因而以 往认为SP对组织修复的影响有限。近

6、年来研究已证实，与组织修复有 关的成纤维细胞、上皮细胞也可表达SP,损伤组织中SP含量变化与感 觉神经纤维的数量以及愈合类型关系密切：在肉芽组织增生阶段，感 觉神经纤维的数量和SP含量均高于肉芽组织成熟期；增生性瘢痕组织 中SP含量高于正常皮肤或生理愈合的瘢痕组织2。因此，人们推测 感觉神经释放的SP和组织细胞表达的SP存在某种联系，SP是周围神 经调控组织修复重要因子。为了验证上述假设，作者所在的课题组对 此开展了较深入的研究，本文报告其主要研究成果。1SP为介导感觉神经调控伤口愈合的重要细胞因子以大剂量辣椒素化学毁损成年大鼠感觉神经后行皮肤全层切割伤辣 椒素组，免疫组化示肉芽组织细胞间隙、

7、成纤维细胞和毛细血管周围 SP CGRP免疫阳性染色明显弱于感觉神经正常组，伤后3天、9天，辣椒素组SP CGRP免疫阳性染色的吸光度分别为感觉神经正常组 53.23%、64.80%和42.70%、40%3。辣椒素组大鼠伤口愈合延迟明 显，伤后12天伤口面积仍为感觉神经正常组的 2倍，肉芽组织肌成纤 维细胞标识物彳 肌动蛋白Q SMA数量减少4。链脲佐菌素STZ 诱导的2型糖尿病大鼠的皮肤感觉神经 A3类有髓神经髓鞘水肿、变性， 无髓神经空泡样变性，微管、微丝排列紊乱，酶联免疫ELISA检测示皮肤SP含量仅为正常皮肤的24.64%- 38.35% 5。胎兔损伤皮肤修复呈无瘢痕愈合，免疫组化示愈

8、合皮肤SP CGRP阳性 染色数量低于成年兔。将已浸泡10-4mol/LSP的聚乙烯醇海绵放置于胎 兔皮肤切口内，然后将胎兔送回子宫内，伤后7天剖腹取出致伤胎兔， 见胎兔皮肤切口处有明显瘢痕形成；如胎兔皮肤切口内放置已浸泡生 理盐水SP溶剂的海绵，愈合皮肤无瘢痕，镜下无明显纤维组织增 生以及胶原沉积6。研究结果提示，胎儿皮肤无瘢痕愈合与 SP低水 平表达有关。2成纤维细胞、表皮干细胞SP表达受外源性SP调控采用定量PCR Westernblot、ELISA等方法证实表皮干细胞可表达 SR 为了解感觉神经末梢释放的神经肽对修复细胞表达 SP的作用，以SP10-510-7mol/L刺激体外培养的皮

9、肤和增生性瘢痕的成纤维细胞、皮肤表皮干细胞，分别检测刺激前后细胞内 SP基因、蛋白表达和培养 液中SP浓度。结果说明外源性SP刺激后，皮肤和增生性瘢痕成纤维 细胞SPmRNA水平和培养液中SP浓度均显著升高，刺激后24小时仍 高于刺激前水平，皮肤成纤维细胞 SP基因和蛋白表达的峰值时相较增 生性瘢痕提前3小时7SP刺激表皮干细胞后3小时，内源性SP基 因和蛋白表达显著上调，分别在刺激后14小时和18小时到达峰值；阻断SP特异受体(陋1和NK 2)抑制SP表达上调8。上述结果 说明成纤维细胞、表皮干细胞表达 SP受外源性SP的影响，提示在皮 肤损伤时存在感觉神经末梢释放 P物质可引起修复细胞长时

10、程神经 内分泌反响，这可能是损伤组织 P物质含量高的重要原因。3SP可调控肉芽组织成纤维细胞表达生长因子及受体3.1SP调控生长因子及受体表达的量效与时效特征以往研究已证实，SP可刺激免疫细胞释放生长因子，但对修复细胞的作用尚无报告。本研 究发现大鼠皮下注射辣椒素 50mg/kg毁损感觉神经1周后行皮肤全层 切割伤，伤口肉芽组织SP免疫阳性染色减弱与表皮生长因子(EGF及受 体(EGFR、成纤维细胞生长因子2(FGF 2)、成纤维细胞生长因子受体 1(FGFR 1)的基因表达抑制同步。不同浓度(10-910-5mol/L)SP作 用于培养大鼠肉芽组织成纤维细胞，RT PCR、Westernbl

11、ot检测示SP 可上调培养肉芽组织成纤维细胞表达EGF FGF 2、转化生长因子卩l(TGFp 1)及其受体的基因和蛋白表达。调控生长因子与受体表达 的SP浓度阈值不同，通常上调生长因子表达的SP浓度低于对相应受体上调的浓度，如上调成纤维细胞内源性 EGFmRNA EGFRmRNA表达的SP浓度分别为10-810-6mol/L和10-610-5mol/L,上调FGF 2和 FGFR lrnRNA表达的sp浓度分别为 10-9io-5moi/L和io-6 10-5mol/L 9。采用上调上述生长因子及受体表达至峰值的 SP浓度作用于成纤维细胞， 观察作用后表达的时效关系。实验证实，SP作用后上述

12、生长因子及受体mRNA表达大多持续至作用后6小时，蛋白质水平表达持续至16 24 小时9, 10。上述研究结果提示，SP不仅有直接促进损伤修复的作用1，同时上 调肉芽组织成纤维细胞表达生长因子与受体， 放大 S的促修复作用； 调控不同的生长因子与受体表达的 SP浓度阈值不同。3.2成纤维细胞核因子NF KB激活是SP上调生长因子表达的重要通路 NF幽是存在细胞浆的快反响转录因子，调控众多的细胞因子和生长 因子的表达，以凝胶电泳阻滞实验EMSA检测SP刺激后的成纤维细胞 NF KB的DNA结合活性。研究发现10-7mol/L浓度SP作用30分钟， NF KB活性可到达峰值；SP特异的受体NK1受

13、体阻断剂GR73632 可阻断SP的刺激效应。SP对NF KB的活化可分别被抗氧化剂 PDTC 和钙离子拮抗剂BAPTA AM抑制，提示sp的活化作用可能是通过氧 自由基和钙离子介导。采用NF kB硫代寡核苷酸圈套能明显抑制成纤 维细胞FGF 2表达，但对EGF表达无明显作用11, 12。4SP在表皮干细胞迁移、分化中的作用及机制4.1SP是调控表皮干细胞增殖、迁移、分化的重要因子采用STZ糖尿病大鼠模型，观察皮肤神经肽含量病理性减少对表皮干细胞增殖的影响， 结果发现腹腔注射STZ后 1周至4周，糖尿病大鼠皮肤SP含量与表皮 基底层表皮干细胞标识物B1整合素、K19阳性染色细胞数均呈进行 性下

14、降，两者明显相关；STZ糖尿病大鼠创面局部应用 SP创缘及新 生上皮B1整合素、K19阳性细胞数较对照组明显增加13。提示SP 是维持表皮干细胞增殖的重要因子。以往认为表皮干细胞的迁移、分化主要与细胞外基质成分的改变、细 胞之间的接触、EGF FGF等细胞因子的作用有关，对感觉神经肽的作 用了解甚少。本研究利用干细胞核标记滞留的慢周期性，以5溴2 尿嘧啶脱氧核苷BrdU注射Wistar新生鼠，8周后行皮肤全层切割伤， 观察伤口内BrdU和表皮干细胞标志物K19、B1整合素双重免疫阳性 的细胞分布与伤口应用 SP的关系14。研究发现皮肤全层切割伤后 创缘与创面中每日注射 SP10-7mol/L

15、250卩11次，伤后3天和5天分 别在创缘和肉芽组织可见 BrdU及K19、B1整合素免疫阳性细胞，说明 表皮干细胞已迁移进入上述组织；未注射 SP的大鼠创缘阳性细胞数明 显少于注射SP的大鼠，肉芽组织也未见免疫阳性细胞。如以大剂量辣 椒素预先毁损感觉神经后行皮肤切割伤，伤后3天创缘BrdU阳性数仅 为未注射SP的大鼠的14.43% 14。进一步研究说明，迁移入肉芽组 织的表皮干细胞除可分化为成纤维细胞外，也可跨胚层分化为血管内 皮细胞。此外，有文献报告，在损伤角膜局部，应用SP可诱导血液中 骨髓间充质干细胞向损伤部位迁移，促进修复 15。为了解SP对表皮干细胞分化方向的影响，将10-7mol/L浓度SP参加表 皮干细胞培养液中，参加后 96 小时，流式细胞仪检测示， 89.7%的干 细胞分化为整合素a6和CD71高表达的短暂扩充细胞，对照组无变化16。将SP分别参加BrdU标记的大鼠表皮干细胞(来源于表皮基底 层)培养液中，注射干细胞混悬液于毛囊发育不良的裸鼠皮下，并在 回植部位注射SP。注射干细胞混悬液28天后，参加SP的大鼠皮下毛 囊数目明显较未参加SP的裸鼠增多，部份皮下毛囊的毛球、内外毛根 鞘部位的细胞胞核中可见 BrdU阳性染色