核磁共振波谱方法在顺磁金属蛋白紫色震颤菌血红蛋白中的应用

1、核磁共振波谱方法在顺磁金属蛋白_紫色震颤菌血红蛋白中的应用生物物理学报第十四卷第三期一九九八年九月ACTABIOPHYSICASINICAVol.14No.3Se.1998p核磁共振波谱方法在顺磁金属蛋白*-紫色震颤菌血红蛋白中的应用*施蕴渝夏佑林吴季辉光寿红刘琴张海阳粱山(中国科学技术大学生命科学学院;)中国科学院中国科学技术大学结构生物学实验室,合肥,230026摘要金属蛋白由于其所带金属离子具有未配对电子而具有顺磁性,致使弛豫时间缩短、谱线加宽(),50Hz以及谱范围变大,100m,因而具有与抗磁蛋白不同的谱特征。这时一些常用的2DppNMR实验方法将失效。本文探索顺磁金属蛋白的几种NM

2、R实验方法,如溶剂峰抑制、2DMCOSY、NOESY、1DNOE差谱及SUPERWEFT等,并精心设计实验条件使之适用于顺磁金属()蛋白的结构研究。这些实验方法成功地应用于紫色震颤菌血红蛋白met-VtHb-CN。通过这些3+实验找到了与血红素Fe配位的组氨酸,并完成了该金属蛋白的顺磁位移的共振峰的识别、活性中Ka p心质子间距离的测量、抗磁性化学位移及电离常数值的确定二维谱血红素配位组氨酸关键词:顺磁金属蛋白NOE差谱众所周知,NMR已成为解析生物大分子结构-功能关系的有力手段。然而许多蛋白质含有金属离子,随着研究的深入,在解析一些抗磁性蛋白的3D空间结构后,人们的研究兴趣又转移到解析顺磁金

3、属蛋白的3D空间结构上来。因而顺磁金属蛋白的3DNMR结构研究已成为结构研究中的一大热点。顺磁化合物存在未配对电子。包含未配对电子的化合物通常含有一个或几个过渡金属离子。自由基也是顺磁的,包含未配对的电子,但由于其电子弛豫时间长,导致核的横向弛豫时1间短,谱线加宽严重,因而不适于高分辨率的NMR实验。金属蛋白可以是抗磁性的,也可以是顺磁性的,这取决于金属离子的电子排列情况。如与氧或一氧化碳结合的紫色震颤菌血红2+()蛋白VtHb-O、VtHb-CO由于其Fe的电子都已配对,就是抗磁性的,总体的电子自旋22+()S=0;而脱氧震颤菌血红蛋白VtHb,由于其Fe具有四个未配对电子,因而总体的电子自

4、3+()旋S=2;而这里将研究的是与氰结合的正铁震颤菌血红蛋白met-VtHb-CN,由于其Fe2只有一个电子未配对,因而其总体的电子自旋S=1/2;当然也还有S=5/2的状态。(顺磁金属蛋白的NMR谱的最显著的特征是顺磁中心附近的质子共振峰称顺磁位移的)(共振峰的位移和加宽。共振峰的位移导致谱范围的加大。通常,质子谱只有10宽,但顺mpp()磁金属蛋白的质子谱宽将随着金属离子的电子自旋的大小而变化。如低自旋S=1/2氰合正()铁血红蛋白met-Hb-CN的质子谱宽约为30m,而高自旋S=5/2正铁血红蛋白met-pp2Hb的质子谱宽可达100mpp。谱线的宽度也可加宽为几十、几百甚至几千Hz

5、,这取决于观测核与顺磁中心之间的距离以及金属离子的自旋状态,谱线的加宽给高分辨率的NMR谱的获得带来了很大的困难。由于分子量的加大和顺磁弛豫,使得磁化矢量衰减加快,2DNMR实*中法合作项目和安徽省自然科学基金资助课题通信联系人验中的相干转移效率下降,交叉峰减弱,因而给共振峰的识别带来了很大的困难。然而由于顺磁弛豫也使自旋-晶格弛豫时间T缩短,可使用短的实验恢复延时,因而便于累加以提高顺1（磁位移的信号的强度。而且由于顺磁中心附近的核的共振位置的大幅度的移动许多共振峰）将落在抗磁包络0?10m外及这些峰的分散,我们可较为容易地识别它们。即使有些峰落pp（在抗磁区,也可以通过COSY、NOESY

6、的交叉峰而加以识别。对于离顺磁中心很近如距离3.5!的核,其谱线加宽严重,相干转移效率极低,看不到交叉峰,这时可用1DNOE差谱进行谱线识别。本工作精心选择并设计适合于顺磁金属蛋白研究的一些NMR实验方法,并应用于紫色震颤菌血红蛋白的结构研究,获得了一些有意义的结果。1研究方法1.1溶剂峰的抑制生物样品所用溶剂为水或磷酸盐缓冲液,这时质子谱将会出现强大的溶剂峰。溶剂如果只是水,那么在,4.7m位置将出现一个强大的水峰;如果溶剂是磷酸盐缓冲液,那么将可能pp出现两个溶剂峰,一个为出现在,4.7位置的水峰,另一个出现在,3.6处,它的强mmpppp度小于水峰的强度,但远大于蛋白质分子的共振峰的强度

7、。为了保持样品的酸碱性,一般使用磷酸盐缓冲液作为溶剂,于是出现两个溶剂峰。由于强大的溶剂峰影响接收机的动态范围,也使得NMR谱的基线扭曲因此要抑制溶剂峰。最简单最有效的方法还是预饱和方法。为了同时抑制两个溶剂峰,可采用双频率的预饱和。现代的NMR谱仪都具有多个频率通道。可用其中的两个频率通道产生两个频率稍有不同（）的如500.132352和500.131794MHz连续波,然后耦合到一起经功放一起放大后加在发射线圈上。调节频率偏置和功率使对两个溶剂峰的饱和效果最佳。这种双频率的预饱和被插进以下各种1D和2DNMR实验中。1. 22D实验3 对于抗磁性蛋白,2DNMR实验方法可获得详细的溶液结构

8、。这一方法包含两个基本的步骤,一是通过DQF-COSY和TOCSY进行自旋系统识别及获得J耦合即二面角信息,二是通过NOESY实验进行顺序识别及获得质子间的距离信息。然而顺磁离子的存在,使谱线（）（）,信号衰减加快,即T变短,6Hz加宽,50ms。我们知道,在COSY或DQF-COSY谱2兀（）（）里,交叉峰的强度正比于sinJtex-t/T。由于J值较小，如取J=7Hz,那么当t?1p121（九）（）（71ms时,sinJt才达最大=1。但由于T较短,ex/T衰减快,一般经过20-t12p12ms兀）（右的时间，信号就衰减为零,因而sinJtex-t/T的值很小，亦即交叉峰很弱。这正是生1p

9、12（）物大分子分子量?20kDa和顺磁蛋白的COSY谱的一大缺点。另外由于COSY交叉峰是正负交替的,而顺磁蛋白质的NMR谱线又较宽,因而COSY的正负交替的交叉峰将有很大部4 （分被抵消。相反,在顺磁蛋白的NMR研究中,为了获得质子间的J耦合关系,MCOSY幅度）COSY却表现较好。因为即使MCOSY有较强的对角峰,但是由于我们主要关心顺磁位移的共振峰,它们的化学位移相差较大,因而其交叉峰远离对角线,MCOSY的较强的对角峰对它们没有影响。在顺磁蛋白的研究中,主要关心顺磁位移的共振峰之间的联系,因而可缩短实验恢复延393-紫色震颤菌血红蛋白中的应用核磁共振波谱方法在顺磁金属蛋白第3期时,如

10、取100ms。这样可在相同的时间内增加累加次数,提高顺磁部分信号强度。由于抗磁部分的质子弛豫时间T长,而顺磁部分的质子的弛豫时间T短,因而缩短实验恢复延时,对顺11磁部分的信号没有大的影响,却可以大大降低抗磁部分信号的强度,即起到加强顺磁部分信号压制抗磁部分信号的作用。使用短的实验恢复延时的抗磁信号与顺磁信号的比,相对于使用长的实验恢复延时的同一比值,可以降低10-15倍。顺磁蛋白的MCOSY实验的谱宽应该设A置得宽一些。因为谱宽大，步长t短，就能保证取得的所有fid都有较大的强度,这样就有较1强的交叉峰。相反,谱宽越窄,交叉峰越弱。在抗磁蛋白研究中所广泛使用且发挥重要作用的TOCSY实验,在

11、这里却很难发挥其作用。这是因为在TOCSY中有一段均匀混合期,本来就由于谱线较宽而严重衰减的信号再进一步衰减,因而TOCSY谱的交叉峰非常弱,只能看到很少的交叉峰。5 在顺磁蛋白的NOESY谱里,具有较强的交叉峰。这是因为在NOESY谱里,交叉峰强（九）（）（）（冗）度正比于cosJtex-t/T,这样即使ex-t/T存在衰减,但cosJt取值较大1p12p121（冗冗）Jt<</2,于是有较强的交叉峰。而且由于NOESY交叉峰都是同相的,因而也不会出现1rCOSY谱中的那种正负抵消。这里同样可设置实验恢复延时为100ms,而混合延时可取（九）20-30ms。由于NOESY谱的交叉

12、峰在t期间的调制cosJt,不同于MCOSY的调制sin11（九）Jt,因而NOESY的谱宽对NOESY交叉峰的强度的影响没有MCOSY中那样严重。因1此,如果将NOESY谱宽设置为10m,这时也可获得较好的NOESY谱,在抗磁区里的顺磁pp位移的共振峰的交叉峰也清晰可见。1.31DTOE差谱5 ）（TOETruncatedOverhauserEffect差谱可用于测量邻近核之间的NOE关系。在瞬态NOE实验里,为了避免自旋扩散使用较短的混合时间,因而只能产生较弱的NOE差信号。然而在TOE实验里,即使使用较长的混合时间也只有较小的自旋扩散于是混合时间的延长使 得N O E差信号也增强，并且没

13、有或只有较小的自旋扩散。这里必须使用三个频率通道，两个通道用于预饱和溶剂峰，一个通道用于照射某一被考察质子的共振，以便通过NOE增强而识别与被照射质子附近的质子。CNBa1.4SUPERWEFT实验Ba在顺磁蛋白的质子谱里有三类信号：一是溶504剂信号，其弛豫时间较长，如T约为1sec ; 其次1 6 3是抗磁部分质子即远离顺磁中心的质子的信号,FeTa它们的T约为300ms;最后是顺磁部分即顺磁中16()心附近的质子的信号即顺磁位移的共振峰，这a27186a些质子的T较短，约为30 m sSU P ER W E F T 实 16 B验就是利用这三类信号弛豫时间的不同以便消N432除溶剂峰、降

14、低抗磁包络而突出顺磁部分信号的。SUPERWEFT实验脉冲序列即为测量T的1NHis85a冗冗冗翻转-恢复序列,d-d-/2-AQ,这里、12B()StructureofhemeAandFi.1coor2g冗冗冗/2即为、/2脉冲，d、d为延时，AQ为取数123+dinationofitsFe.时间。调剂d、d和AQ就可达到消除溶剂峰、降12低抗磁包络而突出顺磁部分信号的目的。1.5顺磁部分质子间距离的测量()对于血红素及其邻近残基如配位组氨酸中的质子,它们的自旋-晶格弛豫时间主要来自于顺磁弛豫,因此对于这些核,通过自旋-晶格弛豫时间的测量可获得活性中心的结构信7,8息。它们的自旋-晶格弛豫时

15、间由下式确定,61/r()1/Ti1?1i3+其中ri为观测核i与顺磁中心Fe之间的距离。于是对于两个不同的质子i、,有j66()=r/rT/2Ti1i1jj3+7,83+(),那么别的核到Fe的距离就!假设血红素的3CH质子见Fi到Fe的距离为6.1.13g可由上式得出。1.6抗磁性化学位移的确定前已叙述,同一种金属蛋白既可以是顺磁性的,也可以是抗磁性的,这唯一地取决于金属6离子的电子排列。顺磁蛋白的质子的化学位移由两部分组成：一是原有的抗磁性蛋白的相应6质子的化学位移，这部分称抗磁性化学位移；二是由顺磁中心与所考察质子的Fermi接触dia()()相互作用产生接触化学位移和偶极相互作用产生

16、假接触化学位移产生的顺磁性化学位移Ka+()AHA+H?46。顺磁性化学位移与温度T成反比,因此arap66()66=+=+k/3Tdiadiaarap于是通过变温实验及化学位移对温度的线性拟合,就可获得每一个质子的抗磁性化学位9移。电离平衡常数Ka的确定1.7p对于一结合-解离平衡,()为了获得其电离平衡常数对化学位移进行H滴定。对于方程4所示的单电离系Ka,pp10()统,化学位移数据可由方程5来进行拟合,即(H)Ka-p-p10"6(6)obsnan=+-()5(H)Ka-p-p110+()666其中、分别为4式中的A、AH+中的某一质子的化学位移，则是A和AH中同一质naob

17、s子由于快速交换而观测到的化学位移的加权平均值。于是通过拟合就可获得Ka值。p2应用紫色震颤菌血红蛋白VtHb是在细菌中已鉴别的第一个血红蛋白。VtHb具有146个残基,分子量为15775。它由一在缺氧条件下生长的严格需氧微生物Vitreoscilla分泌,它的结构11类似于真核血红蛋白的结构。VtHb可以改善微生物对溶解氧的利用,促进细胞蛋白质及其某些次级代谢物的合成。VtHb的结构研究,无论是在理解它的功能方面还是在为了探索生物的进化过程而比较原核和真核的差异方面，都具有非常重要的理论意义。在1997年，Tarri212coneC.等已获得了met-VtHb及VtHb-N的晶体结构，但有关

18、NMR方面的研究工3作还未曾开始。特别是，对于与鼠结合的紫色震颤菌血红蛋白VtHb-CN,既无晶体结构也无395-紫色震颤菌血红蛋白中的应用核磁共振波谱方法在顺磁金属蛋白第3期A.H2Osolution3020100mppB.H2OsolutionN1H3020100mppC.D2Osolution8cH33cH34Hc04Ht07Ha1NHa7H24HaH2H100C2H4Ha(aC)N1HH,6.8ppm6H1-meso6H1"0m2030pp101sectraNMRofmet-VtHb-cNatFi.2302K.A.H2OHpgsolutionwithout,B.H2Osolu

19、tionwithresaturationdouble-freuencpqyc.D2Osolutionwithdouble-resaturation,freuencresaturation.pqypExperimentalrecoverydelay,100ms;numberofscans,1K.NMR的溶液结构。这里将用上面所叙述的方法对正铁低自旋氰合紫色震颤菌血红蛋白()met-VtHb-cN,S=1/2进行研究,一方面探索顺磁金属蛋白的NMR研究方法,另一方面通过这些研究方法获得紫色震颤菌血红蛋白的活性中心的结构信息。3+紫色震颤菌血红蛋白包含一个血红素。血红素中的Fe是六配位的,除了与血红

20、素中的(四个N原子配位外,还与-cN及组氨酸His85的咪唑环的3号位氮原子配位如Fi所.1g1)H示。Fi.2为met-VtHb-cN的1DNMRHO g 2谱,其中A和B为met-VtHb-cNmpp22,23MCOSY2814274-70161312231517343532221032833302720303020100mppmet-VtHb-CNinD2O,Fi.3MCOSYof7.2at302K.HExeri2gppmental100ms;numberofscans,1K.recoverdela,Double-freuencyyqytoresaturationisusedinorde

21、rsuresssolventeaks.Theinsertsatleftppppare22,23and28,27.RefertoofuartexansionsofeakscationpppppthelabelsofFi.4foreaks.gp溶液的NMR谱,C为met-VtHb-CN的DO溶液的NMR谱。在A中,由于没有使用预饱2和,可看到两个强大的溶剂峰;在B、C中使用双频率的预饱和,溶剂峰得到了很好的抑制。在室温下,met-VtHb-CN的质子共振峰分布在-10?32m范围。其中0?10m范围为pppp抗磁包络,对应于抗磁性蛋白的质子共振区域。当然也有一些顺磁部分的共振峰落在抗磁区。在高场0

22、?10和低场10?32区域的共振峰为顺磁位移的共振峰。mmpppp为了识别顺磁中心附近质子的共振,进行2DMCOSY和NOESY实验。MCOSY和NOESY的谱宽在两维都取60FT后的谱由1024*1024个点组成。每一个fid累加m,2Dpp1024次。MCOSY的原始fid数据由256*1024个点组成,而NOESY则由512*1024个点组成。实验恢复延时取100ms,都采用双频率的预饱和以便抑制溶剂峰。Fi.3为met-VtHb-CN的MCOSY谱。在MCOSY中,可识别5个自旋系统,即血红g素上的7、6丙酸基,4、2乙烯基及配位组氨酸His85。由实线连接的交叉峰产生于血红素中每两个

23、J耦合质子间的相干转移,而虚线连接的交叉峰产生于配位组氨酸His85。Fi.3中左上g角的两个插图是交叉峰22、23及27、28的扩展,它们分别来自于4、2乙烯基。由以虚线连接的COSY图形可识别配位组氨酸的Ha,两个H和NH。这里各共振峰的识别方法可参考文献B397-紫色震颤菌血红蛋白中的应用核磁共振波谱方法在顺磁金属蛋白第3期mpp282127254-714260161329128151191710181920103533334323031202422,23NOESY30302010m0ppNOESYofFi.4met-VtHb-CNinD2O,H7.2at302K.Exerimental

24、gppscans,1K.recoverdela,100ms,numberofDouble-freuencresaturationyyqyp1 susedinordertosolventtimeis30ms.Thecrosssuresseaks.Mixinpppgofinterestarelabeledwithnumberto:Intrahemecrosseaksaccordinpg(aa)(aa)(aaeaks:1,28cH3:7H1,8cH3:7H2,37H1:7H2,4-77H1,7H2:7H1,p0)(aaYYaa)(a)(7H2,8,97H1,7H2:-meso-H,10,11-mes

25、o:6H1,6H2,126H1:0a)()(a)(a)(a)6H1,136H2:6H1,146H1:6H1,156H1:6H2,166H2:6H1,17"0"()(6H2:a)(a)()(6H1,21-6H2,185cH3:6H1,195cH3:-meso,205CH3:MM)(a)(a)(a)meso:4Ht,22,234H:4Ht,4Hc,244H:3CH3,253CH3:-meso,26MP(aaa)(a)()(2H:-meso,272H:2Hc,282H:2Ht,292Hc:2Ht;IntraHis85MM()(a)()()(crosseaks:30H1:H2,31

26、H1:NH,32H1:H,33H2:NH,34H2:pMMMa)(a)H,35NH:H.()4。使用30ms混合时间的met-VtHb-CN的NOESY谱示于Fi.4。MCOSY中的交叉g峰在这里清晰可见，而且出现许多新的交叉峰。结合已识别的MCOSY中的交叉峰和NOESY中新出现的交叉峰，几乎可识别血红素和配位组氨酸中所有的共振峰。()()由文献8和9得知，处在-7.8m的宽峰产生于配位组氨酸的咪晚环的CH。由于pp2CH接近顺磁中心，因此产生较大的顺磁位移和较强的顺磁弛豫。由于CH共振峰强度小，不22可能在NOESY谱中看到它与其邻近质子间的交叉峰。因而只能用TOE差谱来寻找它们之()C4

27、H,10mppH1BC2HC2H3020100mpp3020100mppTOEdifferenceofmet-Fi.5sectrumgpVtHb-CNinD2Oat302Kwithirradiating1C2Hat-7.8m.ExerimentalrecoverpppyHNMRofmet-Fi.6spectrumgCW,100dela,400ms;irradiatintimeofVtHb-CNinD2Oat302Kacuiredygqms;irradiatinowerlevel,55dB;andac2withSUPERWEFTmethod.1=83.2dgpms,d2=81ms,AQ=34.8

28、6ms.cumulatingnumber,32X2000.（、功率为55dB-ms间的联系。met-VtHb-CN的TOE差谱示于Fi.5。用一长度为100g）（6dB对应于100W的连续波照射-7.8处的宽峰,可得到在17.42在MCOSY中mmpppp）已识别,为配位His85的H质子处的一个负的NOE差信号。由此可说明在-7.8m处的1ppB共振峰确为配位组氨酸的咪唑环的CH。2配位组氨酸的咪唑环上的CH也接近顺磁中心,也产生较宽的共振峰。我们用SUPER24WEFT实验来寻找该共振峰。当d、d和AQ分别取83.2ms、81ms和34.86ms时,有较好12的效果。Fi即为met-VtH

29、b-CN的SUPERWEFT谱,从该图可看到两个清晰的宽峰,.6g（处在-7.8m的为CH共振峰,而处在10m的则为C4H共振峰。在Fi.6中,溶剂峰被pp2ppg抑制掉了,抗磁包络和一些顺磁部分的共振峰也受到了不同程度的压制。而离顺磁中心最近（的两个质子,即配位组氨酸His85的咪唑环的CH和CH,由于它们的T可用翻转-恢复法241）测得只有4.2ms,因而它们的纵向磁化在较短的延时d、d里已完全恢复到最大值,信号没12有得到抑制,于是它们的共振峰相对于别的共振峰就得到了加强,也就清晰地显露出来了。为了得到活性中心中各质子到顺磁中心的距离,用翻转-恢复法测量它们的自旋-晶格3+()弛豫时间。

30、然后由2式就可获得被观测质子到顺磁中心Fe的距离。如配位组氨酸His85的3+两个H、NH和咪唑环的CH到Fe的距离分别为5.8、6.0、6.2和3.5!,其它一些邻近质2B3+子到Fe的距离也可类似地测得。通过变温实验可获得顺磁蛋白的顺磁部分质子的抗磁性化学位移。顺磁部分质子的化学位移随温度的变化是线性的,其截距即为对应的抗磁性化学位移。通过拟合可得所有顺磁部分质子的抗磁性化学位移都落在0?11m范围。pp电离平衡常数是一个很重要的物理量,它能反映所测电离平衡反应的带电环境。通Kap过化学位移的H滴定,可获得电离平衡常数Ka值。配位组氨酸的咪唑环在溶液的酸碱性发pp()生变化时,就会产生质子

31、化或去质子化反应。通过化学位移的H滴定和5式的拟合,可获得p配位组氨酸的咪唑环的电离平衡常数为4.95。这一值小于自由组氨酸的值KaKaKappp()()6.59和没有配位的组氨酸残基的值5.88-8.05。由于正电环境使值减小,负电KaKapp环境使值增加,由此可推测这里的配位His85的咪唑环处在一正电环境。显然这是由带Kap3+正电的Fe及咪唑环与之配位造成的399-紫色震颤菌血红蛋白中的应用核磁共振波谱方法在顺磁金属蛋白第3期3结论顺磁金属蛋白的NMR谱具有谱范围大、谱线宽的特点,这给NMR谱的解析带来了一定的困难。但是只要精心地选择实验方法和设计实验条件,还是可以对顺磁位移的共振峰加

32、以识别并获得许多重要的信息。在顺磁蛋白的NMR研究中MCOSY、NOESY较为有效。为了降低抗磁包络,不论1D、2D实验,均使用较短的实验恢复延时。TOE和SUPERWEFT在寻找较弱的顺磁位移的共振峰及这些峰与别的共振峰的联系时,能发挥很好的作用。这些方法已成功地应用于紫色震颤菌血红蛋白met-VtHb-CN的NMR研究中。由这些方法识别了3+血红素及配位组氨酸的共振峰,得到了血红素和配位组氨酸中的质子到顺磁中心Fe的距离。通过变温和滴定实验也得到了顺磁位移的共振峰的对应的抗磁化学位移及配位组氨Hp酸的电离平衡常数。Kap参考文献1 I.Bertini,P.Turano,andA.J.Vil

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