生物检验技术论文

1、酶分析法摘要：蛋白质属性的酶是高效、高度专一的生物催化剂，它和生命活动密切相关。因为酶学在生产实践基础理论研究方面，都起着非常重要的作用。酶分析法则是其中的重要内容，也是目前发展较为迅速的一个领域。酶的选择性及其在低浓度下能催化底物反应的能力，对化学分析有很大的用处。关键词：特征 意义 方法 应用引言：酶的催化反应早已用于底物、激活剂、抑制剂以及酶本身的测定。在19世纪中叶已采用酶法来测定糖类。20世纪40年代初，Warburg曾介绍了一项基于使辅酶还原而用光度法来测量NAD和NADP的方法。最新的发展是电化学法与荧光法的应用。所以，酶分析法已成为一项公认的分析技术。酶分析法包括两种类型：一种

2、是以酶作为分析对象，根据需要对样品进行酶含量或活力的测定，通常称为“酶活力测定”。另一种是以酶作为分析试剂，用以测定样品中用一般化学方法难于检测的物质，如酶的底物、抑制剂、活化剂和辅因子等，一般称为“酶法分析”。两者检测的对象虽有所不同，但原理和方法都是以酶能专一而高效地催化化学反应为基础，通过酶反应速度的测定来检测相应物质的含量。此外，为了获得准确可靠的结果，它们都需要选择适宜的反应条件和测定方法。 酶的特征1酶分析法具有高度的选择性。原则上讲，一种酶只催化一种反应，或者说只能催化某种特定的化合物或对特定的化学键起作用。这是由酶本身的高度专一性作用的特点所决定的。2灵敏度很高。一般可测到01

3、umol·L-1(10-7mol·L-1)。如果与荧光法联用，可高达1nmol·L-1(10-9mol·L-1)左右。 3作用一般比较迅速。大多数酶促反应在30分钟以内可以完成。反应条件很温和，如在常温、常压和pH近中性的条件下，反应速度很快。4酶用量甚微，所以比较经济。 5精确度一般。这主要取决于微量吸管误差，如1ul以下的量，取样误差较大。 同时也与组合方式有关。 6适用范围有一定局限性。 只限于酶、底物、辅酶、活化剂或抑制剂的测定。 7简便程度较差。必须具有酶学知识的操作训练，通常要求尽量减少人为误差，尽可能使所有反应体系条件一致。如加样量、温度、

4、反应时间等都要求比较准确。最适反应条件(如温度、pH等)的确定很重要，一个熟练的酶学工作者，会考虑各种因素，设计的实验比较合理，而且重现性好；未经过专门训练的人，往往容易出错。 酶分析法的意义 酶的应用大致可分为四个方面：(1)用以制造某些产品；(2)用以去除某些物质；(3)用以识别某种化合物；(4)用以测定某种物质。其中(3)和(4)属于酶分析法的范畴。从应用面来看，(1)和(2)最为广泛。例如用酶法生产可的松，用凝乳酶制造乳酪，用果胶酶澄清果汁等。这类事例很多，今后还会日益增加。但另一方面，(3)和(4)的应用也正在迅速扩大.其原因之一是由于酶工业的发展，许多酶能够充分供用。以前酶主要是从

5、动物脏器(如胰脏、心脏、肝脏等)和植物种子中得到。这样，除了原料困难外，同时需要花费大量的劳动力和较长的时间进行分离精制。因而酶的价格十分昂贵，不可能用酶作为分析试剂去测定其它物质，但是随着微生物发酵酶制剂工业的发展，利用各种突变株，已生产出大量的酶。这使得酶的供应从质量和种类上都有了飞跃的发展、酶的价格显善下降。因此，用作分析试剂已成为可能。 酶分析法迅速扩展的第二个原因提由于酶应用形式的发展。由于近十年来酶的圃定化技术有了很快的发展，使酶的反复使用和连续使用成为可能。固定化酶的品种已有不少，它们一方面和自动化测定技术相结合，促使酶自动化分析法的迅速普及。另一方面也正在进一步简便化，或制成含

6、酶的试纸，或制成酶试剂包出售，一般只需要加一定量的水就可以直接使用。由于上述原因，酶分析法正在临床诊断、食品加工和发酵等方面广泛应用。如用葡萄糖氧化酶(EC1134)测定血液葡萄糖是临床检验中常用的方法，而测定某些酶含量也是临床诊断的重要指标。 酶分析法的分类 应用酶作为分析工具的酶分析法可以对酶的底物、辅酶、活化剂或抑制剂进行定量分析。常用的方法有动力学分析法、终点测定法和-酶标免疫铡定法。其中终点测定法应用最为普遍。所谓终点测定法是借助某种酶作用，使被测物质定量地进行转变，然后在转化完成后，测定底物、产物或辅酶物质等的变化量。它分为单酶反应定量法和偶联酶反应定量法。 一、终点测定法单酶反应

7、定量法单酶反应只需要一种催化酶，如下式所示，用这种反应作底物定量时，可以测定底物的减少量，也可以测定产物的增加量。对含有辅酶的酶，测定辅酶的变化量也是有效的方法： 底物减少量的测定在待测物质为底物的酶反应中，如果底物能接近完全地转化为产物(当有99转化成产物时，则认为反应完全)，而且底物又具有某种特征性质(如具有特殊的吸收光谱)时，就有可能直接测定底物的减少量而定量待测物。根据这个原理能进行定量的物质有胞嘧啶(胞嘧啶脱氨酶反应280nm处吸光度的减少)，腺嘌呤(腺嘌呤脱氨酶反应，280nm处吸光度的减少)以及尿酸等。 产物增加量的测定 在被测物作为底物的酶促反应中，如果底物基本上都能转变成为产

8、物，而产物又具有可专一性进行定量测定的物质，那么，根据产物的增加量就能检测底物的量。如各种氨基酸类(LLys、LArg、L一Tyr、LHis、LGlu、LAsp等)和草酸等。都可借助相应的专一性脱羧酶的作用，用Warburg呼吸测定生成的C02。还有一类物质在某种酶的作用下，形成的产物具有特征的，吸收谱带。因丽也能甩此法定量。如黄嘌呤和次黄嘌呤(黄嘌呤氧化酶反应，293nm处吸光度增加)以及CoA(磷酸转乙酰基酶反应，233nm处暖光度增加)等。对于微量物质的分析，还可在反应体系中加入带放射性同位素的第二底物，然后检测产物中放射性物质的参入量，这样可进行高灵敏度的定量。 由辅酶变化量进行底物定

9、量NADH和lNADPH在340nm、处有特征最大吸收峰，其摩尔吸光系数=622×l06，NAD+和NADP+在340nm处没有吸收。所以以NAD+或NApP+为辅酶的脱氧酶反应，通过测定340am处吸光度的变化，就可以对相应脱氢酶的底物作定量分析此法应用范围很广. 辅酶的定量 辅酶种类很多，由于它们在酶系统中非常重要，因而经常妻对它们作定量分析：单酶反应可测定的辅酶有多种，例如，CoA可用磷酸转乙酰酶(PTA，乙酰CoA：正磷酸乙酰基转移酶，EC 2318)进行测定：乙酰CoA在233nm有吸收峰，根据反应生成乙酰CoA，由A233的升高计算CoA含量。克氏梭菌(Ckluyveri

10、)来源的酶已有商品，它作用CoA的Km为56×1-4mol·L-1；NH4+其激活剂。FAD可用猪肾D一氨基酸氧化酶(EC 1433)进行测定：由测压法测定耗氧率可以计算FAD含量。NAD+通常用醇脱氢酶(EC 1111)进行定量： 此反应的平衡常数有利于左向反应，但在高pH(910)和高乙醇浓度下，或再以肼捕获乙醛，则反应向右边进行。因此由A340上升值可计算NAD+含量。单酶定量分析的用酶量 当采用终止法单酶反应作定量分析时，为了使底物或辅酶等被测物质完全转化为产物，可以根据一级动力学作近似处理，以，估算用酶量。这时，若测定底物S的含量，反应速度为dESdt=kS，积分

11、得到t=2.3/k*logS0/S,S0为反应开始前t=0时的底物浓度，s为反应终止时的底物浓度。通常认为，当99的底物变为产物时，即算反应接近完全（测定误差1），因而logS0/S=log100=2。于是t=4.6/k。在一级反因时有v=（Vm/Km）*S=kS,k=Vm/Km,故Vm=kKm=（4.6/t）*Km。当Km以mmol*L-1表示时，此即是每ml反应液的用酶量单位（U）的估算依据。 偶联酶反应定量法当单酶反应产物和原始底物用物理化学手段无法区分时，往往可借助另一酶作为指示酶，通过偶联反应进行定量_分析。如：可分为两类： 以脱氢酶作指示酶 用作偶联指示酶的酶中，应用最广的是以NA

12、D+或NADP+为辅酶的脱氢酶类。有些指示酶可和多条途径偶联发挥作用。 如 上述前三个反应，都可以生成G-6-P，所以它们都能以(743)式中G-6-P脱氢酶作为指示酶反应。通过与它偶联，并在340hm处测吸光度，算出NADPH的变化量，从而分别对葡萄糖、葡萄糖-1-磷酸或果糖进行定量分析。已糖激酶专一性不高。可作用于葡萄糖，也作用于果糖。但是借助指示酶反应偶联法，仍然能够对葡萄糖和果糖分别进行定量。因为葡萄糖只需要已糖激酶，就能生成G-6-P，并可与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶进行偶联测定。而果糖除了需要己糖激酶外，还需要磷酸葡萄糖异构酶才能生成G-6-P。例如，G-1-P的定量测定 在这个反应中

13、，G-1-P和G-6-P很难用物理化学等手段区分。要测定二者的含量都很困难。当与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶反应偶联后,NADPH的生成量很容易从A340的吸光度变化算出。而且NADPH的生成量=G-6-P的消耗量=G-1-P的消耗量 如果反应完全，则可定量测定G-1-P。应当说明：反应体系中磷酸葡萄糖变位酶需要葡萄糖-1，6-二磷酸为辅酶，但它的Km值很低(0.5umol·L-1)在制备的样品中就含有微量的G-1，6-DP，所以，不需要再加。 以脱氢酶以外的酶作指示酶除了脱氢酶可作为指示酶以外，还有些酶也能作为指示酶。如葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化生成的H2O2可与过氧化物酶偶联。这里的过

14、氧化物酶就是指示酶。这里DH2为还原型色素，D为氧化型色素。氧化型色素如邻联(二)茴香胺，二氨基联苯胺在420470nm处有吸收峰。所以，用分光光度法测定D的生成量，就可计算出G的量。这样就能对葡萄糖进行定量分析。 偶联酶分析法中工具酶的用量一在偶联酶分析法中，(739)式中的E1的用量，可以按单酶法计算，E2的用量如何确定?如果E2纯净而价廉，可以大量使用，使k2->这样就可以使中间产物B不能积累，而在测定时间内使99的底物转变为产物C。这时C的浓度用c表示，若以99的A完全由B变成产物C(测定误差1)的浓度，用c表示，定义cc=,称为接近度.动力学分析指出，的值取决于两步反应的速度常

15、数比=k2/k1和时间t的取值。当偶联二步反应以一级反应作近似处理时，t=4.6/k,故由t的取值，可计算出k。在一般酶法分析中，为简化讨论，取t=5min，这时，若=2，则k1=0.92，k2=1.84，可计算出=0.990；=5时，k2=46，=0.997，可以认为反应接近完全。因此，指示酶用量可由下式估算即可： Vm=1.84Km(u*ml-1) (7一46)实际分析时，只要将反应时间稍稍延长(例如7分钟)，就可以使99的底物转变为产物了。对于双底物的反应，只要将另-底物过量，也可以用拟一级反应进行测定。二、酶循环分析法酶循环分析法是在上述酶分析法基础上发展起来的一种超微量分析法。具有极

16、高的灵敏度，可测定飞(fermto-)(10-5)摩尔水平的生物物质。它本身就是为适应神经生化等测定单个神经细胞中的酶及其它超微量物质的需要而发展起来的。从理论上讲，此法可以对一个酶分子或其它物质进行测定。此外，酶循环分析法的循环反应机制本身，可能就是生物机体代谢反应的一种模型系统，故研究它具有重要的理论意义。 酶循环分析法是利用在专一性上相互关联的两种酶反应进行组合、循环，使微量的酶活性或其它物质增幅放大，以达到定量测定目的的分析方法。下面以CoA为例，简介其分析原理。 为了使待测物质CoA得以循环放大，先要选择两种相关的酶反应：磷酸转乙酰酶(PTA)反应和柠檬酸缩合酶(CS)反应。在过量的

17、乙酰磷酸和草酰乙酸存在的条件下，CoA由于PTA的作凋而乙酰化为乙酰CoA，并生成和CoA等量的磷酸；另一方面在CS作用下，乙酰CoA又脱酰基。与此同时也生成与CoA等量的柠檬酸。如此循环，n次以后，就会积累相当于n倍CoA的柠檬酸与磷酸。也就是说CoA得到n倍的放大。此系统再以苹果酸脱氢酶(MDH)为指示酶偶联，在过量NAD+和苹果酸存在下，积累起来的柠檬酸，就可以由NAD+定量地消耗而测出，并计算出辅酶A的量。 图7一5（b)是酶循环分析的原理模型。酶反应动力学的分析指出，为了用酶循环分析法检测极微量的底物S(如图75中的CoA-SH和CoA-S-Ac）反应系统应当满足以下要求：(1)底物

18、A1和A2必须远大于它们的Km值，这时由米-孟氏方程v=VmS/(Km+S)可知，vVm,反应循环得以高速运行；(2)对被测底物Si或S而言，其浓度必须远小于它们的Km值，此时v=(Vm/Km)*S=kS，反应速度才与底物浓度呈一级反应关系，k为一级反应速度常数；(3)酶E1和E2的浓度也必须十分低，因为米-孟氏方程的基本假设之一就是sE，此时才有v=Vm=kE的相关。 在实际应用中，因为A1是大大过量的，因此对S1而言，是一个拟单底物反应。由于S1反应的米氏常数km1一般在10-6_10-5molL-1水平(常例中多为5200umolL-1)，而被测底物S1的浓度在10-9mol·

19、L-1水平，符合SKm的要求。但酶E1的浓度往往达到10-710-5mol*L-1，而大于S1的浓度，不能满足E1S1的条件，即不符合米一孟氏方程推导时的基本假设。因而需要采用Cha等的修正公式处理。 V=Vm1S1/(Km1+S1+E1) (7-47) 此时由于s1Km1，因而反应速度仍可近似地用一级反应描述，即 ： V=Vm1S1/(Km1+E1)=k1S1 (7-48)这里 k1=Vm1/(km1+E1) (749)而最大反应速度Vm1取决于E1，而不是S1,若E1-S1复合物生成产物S2的反应速度常数，用kc1示(相当于米一孟氏方程推导时的k2)，则应有Vmkc1E1，于是 K1=kc

20、1E1/km1+E1 (750)此式表明，当E1<<Km1时，k1将随E1增大而按比例地增大；但若E1接近于Km1或大于Km1时,则k1不再随E1比例增大，而如米一孟氏方程v一S关系那样，按双曲线关系逼近某一定值。故有第(3)条要求，E必须十分低。对于E2的反应也可得到相同的结果。动力 学分析指出，只要S1和S2的浓度一定时，产物P1和P2的生成速度也为一定。当反应进行t分钟(一般为3060分钟)后，Pl和P2的浓度可由下式确定： 式中s为t=0时的S1和S2浓度之和，而 称为循环率.不难看出，当k1+k2为定值时，只有k1=k2时，循环率k才能达到最大值。k由k1和k2求取。由(

21、7-49)式可知，当E1<<Km时，k1Vm1/Km1。改变S1的浓度，测得对应的反应速度v，再通过Lineweaver-Burk作图求得Vm1和Km1，就可计算k1。同理也可求算k2。为了达到最大的循环率，必须k1=k2，由（7-50）式k1E1/(km1+E1),当E1<<Km1时，k1=kc1E1/Km1;同理，k2=kc2E2/km2,当k1=k2时，则有：此式就是选择酶循环法最佳循环率的依据。Km可以由酶学手册查得，也可以由实验求得，kc也可由实验求得。因而可以由此选择最佳E1与E2的比例。酶循环分析法的应用正如：CoA的循环分析所代表的那样，对于其它辅因子的

22、超微量分析都是适用的。例如，NAD和NADP的测定，用分光光度法只能达到10-8mol*ml-1水平，用较灵敏的荧光光度法也只能达到10-12mol·ml-1平，但用酶循环法则可达到10-15mol·ml-1水平。因此，著名的酶法分析专家GGGuilbault指出，辅因子的再生对酶分析来说，意义可能和固定化酶的应用一样重要。RBaricos等(1975)总结了辅因子酶促循环(再生)的文献，根据再生所要求的条件，将酶的辅因子分为三种类型： 类型I(自我再生)，包括辅酶B12、FAD、FMN、谷胱甘肽、磷酸吡哆醛和焦磷酸硫胺素。类型(O2为唯一消耗性底物)，包括FAD、FMN、

23、NAD、NADP。类型(需要除O2以外的消耗性底物)，包括ATP、CoA、CoB12、FADH、FMNH、NADH、NADPH和UTP。 固定化酶在酶分析中的应用固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项新技术。此项技术刚一兴起，就被应用于酶分析之中。关于固定化酶的技术将在第十章叙述。固定化酶主要因其可以反复使用，具有较大的稳定性和干扰较小三个优点，而受到酶分析工作者的青睐。应用固定化酶，还可以使酶分析实现简便化、连续化和自动化，这更是符合分析工作现代化要求的优势所在。固定化酶可以多种方式广泛地应用于分析技术：酶电极、酶试纸、酶柱、酶管、试剂组等等。例如，将酶和相关的物，质固定于纸片或其它载体薄

24、层上，用以检谟4样品中某些物质的大致含量，虽不准确，但简便快速。毕竟固定于纸片上的酶不够稳定，定量也不够准确，实用面不广，故这方面注意不多。酶(膜)电极是研究最早、资料最丰富的一种应用方式；酶牲或酶管已用于各种自动化系统，使用标准的分光光度法、荧光法或电化法来跟踪反应产物和反应物的变化，因而有很广的应用范围。下面分别介绍这两种方式的作用原理。 酶(膜)电极酶电极主要由选择性电极（电子感应器)和覆盖在上面的酶膜组成。酶膜由专一性作用于待测物的酶，经物理的或化学的方法制备，此即酶的固定化。然后，选择一个适宜的基础电极，它能够对待测物|的反应产物或反应物作“反应”(在仪器分析技术中称为“响应”，re

25、sponse).这个基础电极，可以是气体电极，用以测定所有消耗O2的反应、释放NH3或CO2的反应；可以是玻璃电极，用以跟踪产酸、产NH4+反应过程H+浓度的变化；也可以是铂电极，用以鉴定所有涉及电学活性物质或O2浓度变化的酶反应；还可以是某种其它的离子选择电极，例如，CN一电极、NH4+电极、I-电极、S2-电极等。将酶膜贴附于电极的先端感应部位；再剪取一块直径约为电极上酶膜两倍的赛璐玢(玻璃纸)透析膜圆片，将酶膜覆盖包扎起来，一支酶电极就制备成了。更简便的方法是，将酶粉用水或缓冲溶液调成糊状，均匀涂布于电极感应部位，再用赛璐玢膜包扎即成。 将酶加于能聚合成凝胶的物质(如聚丙烯酰胺凝、角叉菜

26、胶等)中，制成酶溶胶，涂布于薄尼龙纱上，使其纱孔中都充满溶胶，然后贴附于电极上，待胶聚合后，再用透析膜覆盖包扎，即成物理包埋电极。 将酶溶液直接滴于玻璃电极韵感应性膜部位，低温下待溶剂挥发后，再滴加双功能试剂(如戊二醛)溶液，低温放置l2小时，使酶与试剂反应而被交联，再小心地用水漂洗除去未反应的酶和试剂，这是一种化学方法制备酶电极的例子。 酶电极制成后，放在缓冲液中浸泡数小时或过夜，以便缓冲液渗入酶膜，并使膜中空气溢出。应用的间隙期间亦应保存于缓冲液中。一支酶电极一般可以反复多次使用，化学结合法制备的酶电极，使用寿命最长，物理包埋的次之，酶粉直接涂布的，使用数次则工作稳定性下降，但制备简单方便

27、。稳定性好的酶电极可以使用上千次，一般包埋法酶电极也。可使用200次左右。 所有的酶电极能感应的底物浓度范围，一般为10_-210-4mol·L-1，有的可高到10-1mol·L-1，或低到10-5mol·L-1酶电极对酶反应作出响应所需的时间，称为响应时值(response-time)。这与不同的基础电极、制作方法、底物性质和浓度、以及pH值、温度、搅拌等操作条件有关。酶膜中的酶量不仅影响电极响应时间，而且影响电极的响应值(response value)。经验表明，1020单位膜的酶量，一般就可以获得较为满意的响应值。 酶电极及其反应，可由图76葡萄糖氧化酶电极

28、示意看出一斑。其反应的工作原理，通常着重从待测物(如底物)和反应产物在反应系统中的扩散作用对反应速度影响方面讨论。由于一般酶电极检测的底物浓度是低的，因此，物质转化可用一级反应动力学处理。酶惦记反应系统的扩散作用，既包括酶膜内的内扩散，又包括酶膜外表面的外扩散。将图76中酶膜部分放大，可用图7-7表示。图中Nernst层指样品液在膜表面不受搅拌影响的滞留液膜层，示其厚度，L示酶膜厚度，x示物质在膜中移动距离，S为底物浓度，P为产物浓度，S和P在液-膜系统中的分布，分别由实线和虚线表示。 式中E为感应器的电极电位，E。为参比电极的电位；A为Nernst系数，即2.3×RTF，R为气体常数，T为开氏温度，F为法拉第常数；Sb为底物在外溶掖中的浓度；B为其它离子影响值；G为反应动力学分析中与扩散因素、酶膜厚度、Nernst层厚度、酶的最大反应速度、Km等有关的综合因子(数学式见上述参考文献)。当BG小于Sb时,E和logSb在一定范围内成线性关系，这就是酶电极用于物质浓度分析的基础。但是，当Sb浓度大于酶的Km时，酶反应已偏离一级反应，则线性关系不再存在。这是酶电极应用中应当注意的事项。由于式中G牵涉到酶电极反应系统的多种复杂的影响因素，而其