ipt基因促进杜仲遗传转化不定芽再生_图文

1、第33卷第6期2011年11月北京林业大学学报JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITYVol33，No6Nov，2011550025贵州省贵阳市花溪区贵州大学南校区农业生物工程重点实验室。责任作者：赵德刚，教授，博士生导师。主要研究方向：植物基因工程。电话mail ：dgzhaoyahoocom地址：同上。本刊网址：http ：journalbjfueducnipt 基因促进杜仲遗传转化不定芽再生李岩赵德刚（贵州大学贵州省农业生物工程重点实验室，贵州大学生命科学学院基因工程实验室，贵州大学教育部绿色农药与农业生物工程重点实验室）摘

2、要：利用农杆菌介导法，将35S 启动子驱动的ipt 基因遗传转化杜仲，分析ipt 基因对杜仲遗传转化不定芽诱导的影响。结果表明：转ipt 基因及空载体，外植体不定芽的分化率分别为0. 96%和0. 93%，差别不明显，但转ipt 基因的单位外植体平均长芽数为3. 1个，明显高于对照的1. 9个，进而促进了杜仲遗传转化的不定芽的诱导，其不定芽诱导率可达2. 95%，明显高于空载体对照的1. 68%。本文首次证明：ipt 基因能够促进转化困难木本植物杜仲的不定芽诱导，为通过该基因与其他功能基因结合提高杜仲遗传转化效率奠定了技术基础。关键词：异戊烯基转移酶基因；遗传转化；杜仲中图分类号：Q943.

3、2；S723. 1+32文献标志码：A 文章编号：1000-1522（2011）06-0090-04LI Yan ；ZHAO De-gang. Ipt gene promoting shoot regeneration in genetic transformation of Eucommia ulmoides OlivJournal of Beijing Forestry University （2011）33（6）90-93Ch ，11refGuizhou Key Laboratory of Agro-Bioengineering ，Laboratory of Gene Engineeri

4、ng in College of Life Sciences of Guizhou University ，Key Laboratory of Green Pesticide and Agricultural Biological Engineering of Ministry of Education ，Guiyang ，550025，PRChinaIn this research ，the ipt gene driven by 35S promoter was transferred into Eucommia ulmoides Olivvia agrobacterium-mediated

5、 transformation ，and the influence of exogenous gene on shoot regeneration was further investigated in the current workThe results showed that compared with control （ipt -free ）line （0. 93%），no significant difference in shoot regeneration efficiency was obtained from the ipt transgenic lines （0. 96%

6、）However ，ipt gene enhanced the shoot number per explant ，which was 3. 1，obviously higher than that of control （1. 9）Thus ipt gene enhanced shoot inductivity of Eulmoides ，which was 2. 95%，evidently high than CK 1. 68%The present research firstly prove that ipt gene can substantially enhance shoot r

7、egeneration of Eulmoides and this lays a foundations for promoting genetic transformation efficiency of Eulmoides Key wordsipt gene ；genetic transformation ；Eucommia ulmoides Oliv杜仲（Eucommia ulmoides Oliv）系杜仲科（Eucommiaceae ）杜仲属植物，为我国特有的珍稀保护树种，已列入中国植物红皮书（稀有濒危植物）第1卷。杜仲既是传统名贵中药，也是温带最具开发利用前景的胶源植物。杜仲的遗传转

8、化较为困难，目前仅有赵丹等1关于FPS 基因遗传转化杜仲的研究报道。异戊烯基转移酶（IPT ）催化细胞分裂素生物合成途径中DMAPP （2'-异戊烯基焦磷酸）和5'-AMP （5'-腺苷-磷酸）缩合和去磷酸化反应，产生异戊烯基单磷酸腺苷，是细胞分裂素生物合成最重要的限速酶2-3之一。ipt 基因来源于根癌农杆菌Ti质粒，编码细胞分裂素生物合成途径中的关键酶即异戊烯基转移酶，它能促进烟草（Nicotiana tabacum ）、矮牵牛（Petunia hybrida ）等植物遗传转化过程的不定芽诱导，提高转化效率4-7本文拟将ipt基因遗传转化杜仲，探讨ipt 基因对杜仲

9、遗传转化效率的影响，为利用ipt 基因提高杜仲转化效率奠定基础。1材料与方法1. 1供试材料根癌农杆菌，菌株EHA105为本实验室保存。ipt 基因植物表达载体由本实验室以pBin19为基础构建，表达载体图谱T-DNA 部分见图1。遗传转化中所用植物材料杜仲取自贵州大学校园。实验中所用PCR 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列如下：ipt P1：5'-ATCGGGTCCAAT GCTGTCCTC-3' ；ipt P2：5'-TGCTTAACTCTGGCC TTGGC-3' ，flp P1：5'-GGGGTACCCAAGTCGACC AATG

10、CCACAATTTGGTATATTATG-3' ，flp P2：5'-CCGATCGAGTTATAT GCGTCTATTTATGTAGG-3' 。图1植物表达载体T-DNA 结构图Fig. 1Constructs for plant expression vector T-DNA1. 2农杆菌介导的遗传转化杜仲种子去外皮，冲洗30min ，灭菌水浸泡过夜，超净工作台中以75%酒精消毒60s ，0. 1%升汞消毒30min ，无菌水漂洗5次。将消毒后的种子接种到MS 基本培养基中。待种胚突破种皮0. 5cm 左右时，将胚剥出，接种到种胚生长培养基中。取20d 龄种胚，将胚

11、轴切成0. 5cm 左右小段，置于分化培养基，黑暗预培养48 72h ，将预培养的外植体投入预先准备好的农杆菌重悬液中，室温下不断摇动，使外植体与农杆菌充分接触，浸泡6 8min ，取出外植体，置于干燥无菌滤纸上吸去多余的菌液，共 培养48h ，此时外植体边缘及培养基开始长出农杆菌菌落，将材料用滤纸蘸净，转入筛选培养基诱导不定芽分化。28d 后比较不同材料的不定芽诱导情况，计算外植体分化率、外植体平均长芽数及遗传转化效率（不定芽诱导率）。外植体分化率=长芽外植体数/外植体总数 100%，外植体平均长芽数=不定芽总数/长芽外植体数，遗传转化效率（不定芽诱导率）=不定芽总数/外植体总数 100%。

12、实验所用培养基成分见表1。除特殊说明以外，实验中所用植物培养基为MS 培养+30g /L 蔗糖+7g /L 琼脂，pH 5. 80，121 灭菌20min 。表1杜仲遗传转化培养基Tab. 1Media used for genetic transformation in E . ulmoides培养基号培养基名称培养基组成1种胚生长培养基MS +2. 0mg /L GA +蔗糖3%+琼脂粉0. 75%2预培养基MS +蔗糖3%+琼脂粉0. 75%3共培养基MS +0. 8mg /L 6-BA +0. 1mg /L NAA +50mg /L AS +蔗糖3%+琼脂粉0. 75%4筛选培养基1M

13、S +0. 8mg /L BAP +0. 1mg /L NAA +50mg /L Kan +100mg /L Timentin +蔗糖3%+琼脂粉0. 75% 5筛选培养基21. 0mg /L 6-BA +0. 1mg /L NAA +50mg /L Kan +100mg /L Timentin +蔗糖3%+琼脂粉0. 75%1. 3转基因植株的检测以CTAB 法提取杜仲叶片总DNA 。因植物表达载体的T-DNA 中含有flp 基因，分别采用flp 重组酶基因特异引物flp Primer 1和flp Primer 2，以及ipt 基因特异引物ipt Primer 1和ipt Primer 2，

14、进行PCR 扩增检测。flp 基因PCR 扩增条件为：94 预变性10min ；94 变性1min ，55 退火1min ，72 延伸1min ，共35个循环；最后72 延伸7min 。ipt 基因PCR 扩增条件为：扩增条件为94 10min ；94 1 min ，58 1min ；72 1min ，共35个循环；最后72 延伸7min 。PCR 扩增产物在1. 0%的琼脂糖中进行电泳检测。 2结果分析2. 1转基因杜仲flp 基因PCR 分析电泳检测结果表明（图2），第5 6道转化Hsp18. 2：flp -35S ：ipt 杜仲芽及第4道转化Hsp 18. 2：flp 杜仲芽均扩增出12

15、70bp 的带，与第3道阳性质粒扩增产物大小一致，而非转基因对照没有扩增出特征谱带。2. 2转基因杜仲ipt 基因PCR 分析电泳检测结果表明（图3），第5、6道转化Hsp18. 2：flp -35S ：ipt 杜仲芽扩增出了325bp 的带，与第1道Hsp18. 2：flp -35S ：ipt 阳性质粒扩增产物大小 图2转基因杜仲flp 基因PCR 分析Fig. 2PCR analysis of transgenic E . ulmoides with flp gene注：1. 标准DNA ：DNA 经BamH ，Hind 双酶切产物；2. 非转基因对照；3. Hsp 18. 2：flp -

16、35S ：ipt 质粒；4. 转Hsp 18. 2：flp 杜仲转基因植株；5 6. 转Hsp 18. 2：flp -35S ：ipt 杜仲转基因植株。图3转基因杜仲ipt 基因PCR 分析Fig. 3PCR analysis of transgenic E . ulmoides with ipt gene注：1Hsp 18. 2：flp -35S ：ipt 质粒；2标准DNA ：100bp DNA Ladder ；3非转基因对照；4转Hsp 18. 2：flp 杜仲转基因植株；5 6转Hsp 18. 2：flp -35S ：ipt 杜仲转基因植株。一致，而转化Hsp 18. 2：flp 杜仲

17、芽及对非转基因对照没有扩增出特征谱带。2. 3ipt 基因对杜仲胚轴遗传转化不定芽诱导的影响 图4杜仲遗传转化Fig. 4Genetic transformation of E . ulmoides注：1. 遗传转化Hsp 18. 2：flp 基因杜仲胚轴不定芽诱导；2. 非转基因对照杜仲胚轴不定芽诱导；3. 遗传转化Hsp 18. 2：flp -35S ：ipt 基因杜仲胚轴不定芽诱导；4. 转Hsp 18. 2：flp 基因杜仲植株试管苗；5. 非转基因对照杜仲植株试管苗；6. 转Hsp 18. 2：flp -35S ：ipt 基因杜仲植株试管苗。由表2，图4可知，转化ipt 基因杜仲胚轴

18、外植体分化率略高于转化空载体对照材料，但差别不明显，分别为0. 96%和0. 93%。但在单个外植体诱导芽密度上，遗传转化ipt 的转基因材料明显高于空载体材料及对照，其单个外植体平均诱导抗性芽数为3. 1，显著高于转化空载体对照的1. 9个及非转基因对照材料的2. 0个，进而提高了杜仲胚轴的遗传转化效率。结果表明：转化ipt 基因胚轴转化效率为2. 95%，明显高于对照的1. 68%，而未经卡那霉素筛选的非转基因杜仲胚轴的不定芽诱导率为29. 81%，筛选材料未见不定芽分化。可见ipt 基因对杜仲胚轴遗传转化中的不定芽诱导具有促进作用。表2转植基因对杜仲胚轴不定芽诱导的影响Tab. 2Sho

19、ot inducement ratio of hypocotyls of Eulmoides transformed with Hsp18. 2：flp -35S ：ipt gene转基因类型外植体分化率/%单个外植体长芽情况平均单个外植体长芽数不定芽诱导率/%Hsp18. 2：flp 0. 931 51. 91. 68Kan +Hsp18. 2：flp -35S ：ipt 0. 962 73. 12. 95Kan +对照未筛选15. 201 52. 029. 81对照经筛选00003结论与讨论杜仲是遗传转化较困难的植物，研究组已获得农杆菌介导的杜仲遗传转化专利授权，但转化效率不高。本研究利用

20、ipt 基因遗传转化杜仲获得转基因杜仲芽，首次证明ipt 基因能够提高转化困难植物杜仲的遗传转化效率，这与之前报道的在烟草、矮牵牛等植物中的研究结果一致4-7。因此ipt 基因可用于杜仲的遗传转化，提高遗传转化效率。在遗传转化外植体的选择上，杜仲胚轴或子叶均可作为外植体诱导不定芽再生，但诱导率胚轴高于子叶8，因此在本研究中采用胚轴为外植体进行杜仲遗传转化计算转化效率。虽然ipt 基因能够促进植物遗传转化中的不定芽诱导，但其表达可增加转基因植物细胞内细胞分裂素含量，引起植物的非正常变化7，9-10。研究采用基因构建中包含热激启动子驱动重组酶基因flp 的基因删除表达元件，可在ipt 基因发生作用后通过热激处理将其删除，避免对植物生长发育带来的负面影响。目前，杜仲基因删除工作正在进行中。参考文献1赵丹，赵德刚，李岩EuFPS 基因表达载体构建及对杜仲遗传转化的研究J . 广西农业生物科学，2009，28（1）：2