Annexin_PI流式细胞分析法和TUNEL法检测肝细胞凋亡的对比研究_图文

1、文章编号:1007-6611(200805-0476-04Annexin/PI流式细胞分析法和TUNE L法检测肝细胞凋亡的对比研究郭晓红,刘立新3(山西医科大学第一临床医学院科研实验中心,太原030001;3通讯作者,E2mail:lixinliu6 摘要:目的通过Annexin/PI流式细胞分析法和TUN EL法检测肝细胞凋亡,比较两种方法的优缺点。方法以体外培养人肝细胞株HL27702为研究对象,分别设立TGF21组(加入TGF21至终浓度为20ng/ml,作用72h后收集细胞进行检测和正常对照组(加入等量PBS,采用Annexin/PI流式细胞分析法和TUN EL法检测肝细胞凋亡。结果

2、Annexin/ PI流式细胞分析显示,TGF21组与正常对照组相比肝细胞的早期凋亡率和总凋亡率均显著增加(10.55±4.71%vs(5.98±2.97%,P<0.01;(19.94±3.68%vs(13.27±4.62%,P<0.05。TUN EL法检测显示,细胞核中有棕黄色着染者为阳性细胞,细胞呈典型的凋亡形态学改变,即表现为变小、变圆、核固缩;而正常细胞的胞核不着染。经Iimage2Pro Plus图像分析软件处理,显示TGF21组与正常对照组相比肝细胞凋亡率显著增加(30.25±6.43%vs(4.75±0.96

3、%,P<0.01。结论Annexin/PI流式细胞分析法特异性高,TUN EL法灵敏度高,两种方法相结合检测细胞凋亡更准确。关键词:肝细胞凋亡;Annexin/PI;流式细胞术;TUN EL中图分类号:Q503文献标识码:AComparative study on Annexin/PI and TUNE L in detecting hepatocyte apoptosisGUO Xiao2hong,L IU Li2xin3(Ex perimental Center of Science and Research,First Clinical Medical College,S hanx

4、i Medical U ni2 versity,Taiyuan030001,China;3Corresponding author,E2m ail:lixinliu6hot m Abstract:ObjectiveTo compare the advantages and disadvantages of Annexin/PI with flow cytometry and TUN EL in detect2 ing hepatocyte apoptosis.MethodsCultured human hepatocyte line HL27702was divided into TGF21g

5、roup(treated with TGF21 20ng/ml for72hand normal control group(incubated with equal PBS.Hepatocyte apoptosis was detected by Annexin/PI with flow cytometry and TUN EL.ResultsCompared with normal control group,the percentages of early and total apoptosis signifi2 cantly increased in TGF21group by Ann

6、exin/PI(10.55±4.71%vs(5.98±2.97%,P<0.01;(19.94±3.68%vs(13.27±4.62%,P<0.05.By TUN EL assay,nuclei stained buffy were detected as positive cells.Meanwhile the cells changed into smaller, rounder and nuclear condensation.But normal nuclei were not stained.The percentage of hep

7、atocyte apoptosis in TGF21group was much higher than in normal control group(30.25±6.43%vs(4.75±0.96%,P<0.01.ConclusionAnnexin/PI with flow cytometry is more specific,while TUN EL assay is more sensitive.It is more precise to combine Annexin/PI with TUN EL. K ey w ords:hepatocyte apopto

8、sis;Annexin/PI;flow cytometry;TUN EL参考文献:1Nisolle M,Donnez J.Peritoneal endometriosis,ovarian endometri2osis,and adenomyotic nodules of the rectovaginal septum are three different entitiesJ.Fertil Steril,1997,68:585-596.2戈一峰,黄宇峰,胡毓安,等.人子宫内膜细胞的纯化和培养J.医学研究生学报,2005,18(6:496-498.3谭先杰,刘东远,郎景和,等.子宫内膜腺上皮及基

9、质细胞分离、培养作为子宫内膜异位症体外细胞模型的探索J.现代妇产科进展,2002,11(1:30-32.4Casey ML,MacDonald PC,Mitchell MD,et al.Maintenance andcharacterization of human myometrial smooth muscle cell in mono2 layer cultureJ.In vit ro,1984,20(5:396-403.5ZHU Xue2Qing,SHI Y i2Fu,CHEN G Xiao2Duan,et al.Immuno2histochemical markers in diff

10、erential diagnosis of endometrial stro2 mal sarcoma and cellular leiomyomaJ.G ynecol Oncol,2004,92: 71-79.6司徒镇强,吴军正.细胞培养M.1版.西安:世界图书出版公司,1996:92.7Hong IS,K im SH,K oong M K,et al.Role of p38and c2jun in thedifferentiation proliferation and immortalization of normal human endometrial cellsJ.Hum Repro

11、d,2004,19(10:2192-2199.作者简介:韩妍,女,1975-02生,在读硕士,主治医师,现在长治市人民医院妇产科工作.收稿日期:2007-12-20基金项目:国家人事部留学回国人员择优基金资助项目(200499;山西省自然科学基金资助项目(20051092;太原市科技明星专项基金资助项目(070204004细胞凋亡,即程序性细胞死亡,在许多生理和病理调节过程中发挥着重要作用,其定性和定量检测无论对于基础研究还是临床用药,都有指导意义。随着对细胞凋亡研究和认识的不断深入,已有多种检测方法得到广泛应用。然而如何选择适当的方法并对检测结果作出正确的判断及恰如其分的解释仍是值得探讨的问

12、题。本研究拟通过磷脂结合蛋白/碘化丙啶(Annexin /PI 流式细胞分析法和原位末端脱氧核苷酸转移酶(TdT 标记法(TUN EL 法检测转化生长因子1(transforminggrowth factor 1,TGF 21诱导的人肝细胞株凋亡,以比较两种方法在测定细胞凋亡时的优缺点。1材料与方法1.1材料人肝细胞株(HL 27702(购于上海生命科学院细胞研究所;TGF 21(英国Peprotech 公司;Annexin 2FITC 试剂盒(美国BECK MAN COUL TER 公司;TUNE L 检测凋亡试剂盒(美国R &D 公司。流式细胞仪(FACSCalibur ,美国BD

13、 公司。1.2方法含10%胎牛血清的RPM I1640培养液中,37、5%CO 2条件下培养,隔天换液,待细胞长至90%密度时,0.25%的胰蛋白酶消化传代。ng/ml 的TGF 21作用于培养细胞,72h 后收集细胞及其上清液进行500×g 、4离心5min ,弃上清;冰PBS 洗细胞一次,重悬400目筛网过滤,计数,再次离心,弃上清;冰1×binding buffer (一种缓冲液将细胞调为1×106/ml ,取100l 细胞悬液加入5l Annexin 和2.5l PI 染液(终浓度250g/ml ,轻轻振荡混匀,冰上避光10min ;加入400l 冰1&#

14、215;binding buffer 轻轻振荡,30min 内进行流式细胞定量分析。TGF 21,72h 后将细胞用3.7%中性福尔马林室温固定10min ;经100%、95%、70%梯度酒精室温各5min 水化,PBS 室温洗10min ;每张切片滴加50l Cytonin (一种非蛋白水解的破膜剂,室温30min ,DNase 2free 水洗2min ×2次;新鲜配置的3%H 2O 2溶液,室温5min ,PBS 洗1min ;TdT 标记缓冲液室温孵育5min ;每张切片滴加50l 标记反应混和液,371h 后用TdT 终止缓冲液室温作用5min ,PBS 洗2min 

15、15;2次;50l Streptavidin 2HRP Detection Solution 室温20min ,PBS 洗2min ×2次;DAB 显色。1.3统计学分析所有数据均以 x ±s 表示,采用SPSS11.5统计软件进行分析,组间比较用SN K 2q检验,以P <0.05为差异有统计学意义。2结果2.1Annexin /PI 流式细胞分析法检测TGF 21诱导的肝细胞凋亡正常活细胞Annexin 及PI均低染(Annexin -PI -,分布在流式细胞分析图的左下区(LL ;早期凋亡细胞Annexin 高染而PI 低染(Annexin +PI -,分布在图

16、的右下区(RL ;晚期凋亡或死亡细胞Annexin 及PI 均高染(An 2nexin +PI +,分布在图的右上区(RU (见图1。将早期凋亡细胞百分数(RL 和晚期凋亡细胞百分图1Annexin /PI 流式细胞分析检测肝细胞凋亡Fig 1Hepatocyte apoptosis detected by Annexin /PI with flow cytometry数(RU 之和称为总凋亡率。结果显示TGF 21组与正常对照组相比肝细胞早期凋亡率显著增加(P <0.01,总凋亡率亦显著增加(P <0.05,见表1。表1Annexin /PI 流式细胞分析检测肝细胞凋亡的结果T

17、ab 1The results of hepatocyte apoptosis by Annexin /PIwith flow cytometryn总凋亡率(%早期凋亡率(%正常对照组413.27±4.62 5.98±2.97TGF 21组819.94±3.68310.55±4.7133与正常对照组相比,3P <0.05,33P <0.012.2TUN EL 法检测TGF 21诱导的肝细胞凋亡细胞核中有棕黄色着染者为凋亡细胞,被染上棕色的细胞呈典型的凋亡细胞形态学改变,肝细胞变小、变圆、核固缩;而正常细胞的胞核不着染(见图2。每张切片在高倍视

18、野下(×200取5个视野,计数5个视野中每100个细胞中染色阳性的细胞数(%,取其平均数。经Image 2Pro Plus 图像分析软件处理,显示TGF 21组与正常对照组相比肝细胞凋亡率显著增加(P <0.01,见表2。 图2TUN EL 染色检测肝细胞凋亡(×200 Fig 2Hepatocyte apoptosis detected with TUN EL (×200表2TUNE L 法检测肝细胞凋亡的结果T ab 2The results of hepatocyte apoptosis with TUNE Ln凋亡率(%正常对照组4 4.75

19、7;0.96TGF 21组830.25±6.43#与正常对照组相比,#P <0.013讨论细胞发生凋亡时首先出现细胞核固缩、染色质浓集,细胞体变圆皱缩等形态学改变,在胞质内形成多个膜结构尚完整的“小泡”及“凋亡小体”1。同时出现细胞膜的特异性改变,原位于胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS 迁移至脂双层外侧2,暴露于细胞外环境中,但细胞膜仍保持完整。另外,核酸内切酶被激活,将DNA 降解,形成长度为180-200bp 的DNA 片断。而坏死细胞DNA 断裂无规律性。1995年Vermes 等3首先利用对PS 有高度亲和力的Annexin 检测细胞凋亡。由于坏死细胞PS 亦暴露于细胞膜外

20、表,使Annexin 结合阳性,因此单独用Annexin 不能区分细胞坏死或凋亡,必须同时采用PI 这一坏死细胞染色阳性的染料将坏死细胞区分出来。所以,用荧光标记Annexin 与PI ,通过流式细胞仪可同时区分活细胞、凋亡早期和凋亡晚期或坏死细胞4。本研究用该法检测TGF 21诱导的肝细胞凋亡,结果显示:终浓度为20ng/ml 的TGF 21作用于培养细胞72h 后,无论是肝细胞的早期凋亡率还是总凋亡率均较正常对照组显著升高(P <0.01,P <0.05。细胞凋亡中染色体DNA 的断裂是个渐进的分阶段过程,染色体DNA 首先在内源性核酸水解酶的作用下降解为50-300kb 的大

21、片段。然后大约30%的染色体DNA 在Ca 2+和Mg 2+依赖的核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断,形成180-200bp 的寡聚核苷酸。DNA 双链断裂或只要一条链上出现缺口即产生一系列的DNA 3-OH 末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(Td T 的作用下,将脱氧核糖核苷酸和辣根过氧化物酶形成的衍生物标记到DNA 的3-末端,而正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂,没有3-OH 形成,很少能够被染色。因此可进行凋亡细胞的检测,即TUN EL 法5。本研究据此检测TGF 21诱导的肝细胞凋亡,结果显示终浓度为20ng/ml 的TGF 21作用于培养细胞72h 后,肝细胞

22、凋亡率亦显著高于正常对照组(P<0.01。Annexin/PI流式细胞分析法和TUN EL法是检测细胞凋亡的两种常用方法。TUN EL法是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,广泛应用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养细胞以及组织分离细胞的凋亡测定,可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度高。它利用DNA的断裂来标记凋亡细胞,不需要特殊仪器,方法简单易行。但TUN EL法亦有它的局限性6-8:只能标记中期及晚期的凋亡细胞;细胞坏死时也会发生DNA 断裂而被dU TP标记,因此不能区别凋亡和坏死细胞,并

23、会将坏死细胞计入凋亡细胞,特异性较差;标记过程中需固定细胞,易导致细胞碎片过多或DNA片段丢失;凋亡细胞计数时易受主观因素的影响。我们用TUN EL法检测处理组的肝细胞凋亡远高于Annexin/PI流式细胞分析法的检测结果(30.25±6.43%vs(19.94±3.68%,可能也提示它的特异性差。细胞凋亡时细胞膜上的PS外露,使细胞膜丧失不对称性是细胞凋亡的早期事件2,9,早于DNA 断裂3,且通过Annexin与PS特异性结合、PI与坏死细胞结合可将凋亡细胞与坏死细胞区分开来,因此用Annexin/PI流式细胞分析法能更灵敏、特异地检测早期凋亡细胞。此法进行荧光标记后直

24、接上机检测,不需固定细胞,避免了TUN EL法因固定出现的DNA片段丢失,并且不受主观因素影响,简单、快速,结果更可靠。但晚期凋亡和坏死细胞的胞膜均已破坏,PS也暴露于胞膜外侧,不能区分晚期凋亡与坏死细胞。试剂盒价格昂贵也限制了它的广泛应用。尽管有透射电镜或荧光显微镜形态学观察、DNA凝胶电泳、EL ISA法、PI单染色法以及cas2 pase23活性检测等多种方法检测细胞凋亡,但每种方法各具特点,均有其局限性,目前尚无一种完美的检测手段。因此在凋亡检测中应避免使用单一方法,需考虑实验室条件、样本来源和研究目的,选择两种或两种以上的方法,检测细胞在凋亡发生过程中的不同事件,才能更准确、客观、全

25、面地反映实验结果。参考文献:1Hacker G.The morphology of apoptosisJ.Cell Tissue Res,2000,301(1:5-17.2Fadok VA,Voelker DR,Campbell PA,et al.Exposure of phos2phatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophagesJ.J Immunol, 1992,148(7:2207-2216.3Vermes I,Haanen C,Steffens2Nakken H,et al.A novel assay forapoptosis flow cytometric detection of phosphatidylserine expres2 sion on early apoptotic cells using