DC_CIK细胞临床制备规范化研究

1、DC -CIK 细胞临床制备规范化研究张志伟,宋鑫(昆明医学院第三附属医院云南省肿瘤医院生物治疗中心,云南昆明650118A Study on Standardization of Culture of DC -CIK Cells for Clinical ApplicationZHANG Zhi -wei,SONG Xin摘要:树突状细胞(DC 与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK 共培养,具有显著的协同抗肿瘤效应,逐渐成为肿瘤过继性细胞免疫治疗的首推方案。DC -CIK 的协同抗肿瘤效应不仅在体外实验得到了证实,而且临床试验也证实了DC -CIK 的强大抗肿瘤效应。然而目前国内外还没有关于DC

2、 -CIK 细胞制备的统一技术规范,为此我们结合国内外知名实验室的制备经验,对DC -CIK 细胞制备的技术规范进行探讨,以保证其临床应用的质量和安全。关键词:肿瘤免疫治疗;树突状细胞;细胞因子诱导的杀伤细胞;规范化中图分类号:R730.51文献标识码:A 文章编号:1004-0242(201102-0085-04DC -CIK 细胞因其高效的杀瘤效应,逐渐成为肿瘤过继性细胞免疫治疗的最佳方法之一。树突状细胞(dendritic cells ,DC是目前已知功能最强的专职抗原提呈细胞,成熟DC 细胞可有效的诱导抗原特异性T 细胞增殖和活化,是机体抗肿瘤免疫反应的主要启动者和参与者1,2。细胞因

3、子诱导的杀伤细胞(cytokine -in -duced killer cells ,CIK ,是单个核细胞经多种细胞因子刺激产生的一群以CD3+CD56+细胞为主的异质细胞,其兼有T 细胞强大的抗瘤活性与NK 细胞的非MHC 限制性杀瘤特点3,4。DC 和CIK 共培养,具有显著的协同抗肿瘤效应。M 覿rte 等5研究发现,负载肿瘤抗原的DC 能提高CIK 的杀瘤特异性,同时CIK 能促使DC 表面共刺激分子表达增加,提高其抗原提呈能力。令人振奋的是,临床试验显示:DC -CIK 细胞过继免疫治疗对于非小细胞肺癌和骨肉瘤患者均有很好的临床疗效6,7。然而目前国内外还没有关于DC -CIK 细

4、胞制备的统一技术规范,为此我们结合国内外知名实验室的制备经验,对DC -CIK 细胞制备的技术规范进行探讨,以保证其临床应用的质量和安全。1DC -CIK 细胞制备的基本条件我们参考国家食品药品监督管理局2003年制订的人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则、卫生部2009年制订的第三类医疗技术管理规范自体免疫细胞(T 细胞、NK 细胞治疗技术管理规范和美国FDA 1998年制订的人体细胞治疗和基因治疗指导原则,同时结合本实验室的DC -CIK 细胞制备经验,对DC -CIK 细胞制备的基本条件制订如下规范。1.1临床科室和细胞制备实验室具有与自体免疫细胞治疗相对应的临床科室,科室人员组成

5、包括有与开展人体免疫细胞治疗技术相适应的执业医师、执业护士、具有免疫学专业背景的专家和自体免疫细胞制备的技术人员;具备开展自体免疫细胞治疗技术的场地、设备和设施;具备从事自体免疫细胞治疗质量控制的专业检验科室和人员。细胞制备中心主要由血细胞采集室、细胞制备实验室和细胞质量检测室三部分构成,其中细胞制备实验室应具备省级以上药品监督管理部门和疾病预防控制收稿日期:2010-07-15基金项目:国家教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET -08-0923;国家自然科学基金(30760014,81060185;昆明市科技计划重点项目(昆科07S060202;云南省科技厅昆明医学院联合基金(2007

6、C0022R ;云南省科技厅科技创新强省国际合作专项(2009AC016。通讯作者:宋鑫E -mail:songxin68中心认证的GMP制备室;有细胞采集、加工、检定、保存和临床应用全过程的标准操作程序(stan-dard operation procedure,SOP和完整的质量管理记录;制定并遵循GMP实验室维护标准操作程序(SOP;遵循细胞产品质量控制标准并拥有与其配套的检测设备和检测方法。1.2人员配置临床科室应有10年以上开展细胞技术临床应用相关专业临床诊疗经验,具有副主任医师及以上专业技术职务任职资格,经过卫生行政部门认可的自体免疫细胞治疗技术系统培训并考核合格的自体免疫细胞治疗

7、医师。血细胞采集室应有护理专业大学(专本科及以上学历,经专业技术培训并考试合格的执业护士。细胞制备实验室至少有1名副高级以上专业技术职务任职资格的总体负责人,从事细胞制备的操作人员具有相关专业(生物、免疫、检验和医学大学(专本科及以上学历,有不少于50例实验性免疫细胞制备经验,经过细胞制备相关专业系统培训并考核合格。细胞质量检测室应有检验相关专业大学(专本科及以上学历,经专业技术培训并考试合格的专业检验人员。1.3材料和试剂血细胞采集的管道和相关材料必须保证一人一套,防止交叉感染和其它不良反应。DC-CIK细胞制备试剂要求:细胞制备过程中使用的细胞培养成分和添加物(培养液、细胞因子、血清等以及

8、制备过程所用的耗材,其来源和质量认证,应符合临床使用的质量要求;分离、纯化细胞产品所需试剂和器械均必须经食品药品监督管理部门审批,具有临床应用的许可证;一次性耗材不能重复使用;使用经药品监督管理部门审批的医用物品和耗材,建立登记制度,保证来源可追溯。1.4细胞制备质量控制细胞质量指标:每批细胞应注明来源并加以标记或确定批号;细胞数量应满足临床最低需求,存活率应不低于80%;纯度和均一性达到临床应用水平;体外检测细胞具备正常功能和生物学效应,如细胞具有的某种生物学功能,分泌某种产物的能力,表达某种标志的水平等。细胞制品外源因子的检测包括:细菌、真菌、支原体和内毒素。参照现行版中国药典生物制品相关

9、规程进行。无菌试验:每批培养的细胞在患者输注前均应进行无菌试验。建议在培养开始后34d起每间隔一定时间取培养液样品,包括患者回输前48h取样,按现行版中国药典生物制品无菌试验规程进行。在患者使用前,取培养液及/或沉淀物用丫啶橙染色或革兰染色,追加一次污染检测。进行长期培养的细胞,应进行支原体检查。对每一批细胞终制剂应留样检测。如果留样发现阳性结果,应及时对生产过程进行检查。如果在细胞制备的早期发现有污染的情况,应终止该批细胞制品的继续制备。细胞制备实验室应具有自体DC-CIK细胞制备及检定过程的原始记录和检定报告,并永久保存。2DC-CIK细胞的制备流程通过与国内外多家知名肿瘤生物治疗中心交流

10、和合作,结合各中心DC-CIK细胞的制备经验,我们生物治疗中心对DC-CIK细胞的临床制备流程进行了深入探讨并制订出如下规范(流程见图1。2.1采血前检查患者在进行血细胞采集之前,必须经过检验证明肝炎病毒(HAV、HBV、HCV、HDV和HEV、HIV-1/2、梅毒螺旋体及寄生虫感染等均为阴性,同时还要排除自身免疫性疾病(如慢性淋巴性甲状腺炎、溃疡型结肠炎、重症肌无力、多发性硬化病、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎、干燥综合 征、系统性红斑狼疮和混合型结缔组织病等,必要时需说明患者自体的血清学、诊断学及临床资料。2.2外周血单个核细胞采集无菌条件下,由专职人员使用血

11、细胞分离机采集患者自体外周血单个核细胞8(peripheral blood mononuclear cell,PBMC,细胞数量达到(13×108以上,必须保证一位患者一套采集管道。2.3肿瘤抗原的制备手术切除的肿瘤标本,无菌条件下,将癌旁非肿瘤组织去除干净,浸于PBS溶液中;然后用手术刀将组织块切碎,浸于包含0.5mg/ml型胶原酶和75U/ml 型DNA酶的消化液中,37孵育30min,收集细胞;细胞经过液氮和37温箱反复冻融5个循环,收集细胞裂解物并通过0.2m 滤器过滤,-80保存备用9。肿瘤细胞裂解物采用BCA法测定蛋白浓度。2.4DC细胞的培养及鉴定收集的PBMC重悬于无

12、血清培养基中,置于37,5%CO2培养箱孵育2h,去除非贴壁细胞,加入rhGM-CSF1000U/ml和rhIL-4500U/ml,刺激细胞向DC 细胞分化10,11;根据生长情况每23d进行一次半量换液;在培养的第5d,加入肿瘤抗原裂解物50g/ml9,刺激抗原特异性的DC 细胞产生;在培养的第6d,加入IL-1,IL-6和TNF等细胞因子12,13,刺激DC细胞成熟;在第7d,收获DC细胞,其数量应达到1×106个以上,台盼蓝染色检测细胞活力应在80%以上,流式细胞仪检测DC细胞免疫表型CD11c、HLA-ABC、HLA-DR、CD40、CD80、CD83和CD86等的表达,成熟

13、的DC高表达这些表面标记14,15。2.5CIK细胞的培养及鉴定收集的PBMC重悬于无血清培养基中,置于37,5%CO2条件下孵育2h,收集非贴壁细胞,加入1000U/ml的IFN-培养16,24h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和500U/ml的rhIL-217,18,刺激CIK细胞的生长和增殖;根据生长情况每23d进行一次扩瓶传代培养;在第7d,收获CIK细胞,其数量应达到1×109个以上,台盼蓝染色检测细胞活力应在80%以上,用流式细胞仪检测细胞免疫表型HLA-DR、CD3、CD4、CD8、CD45和CD56等的表达19,20,其中CD3+CD56+的细胞应达到20%以上

14、。2.6DC-CIK细胞的制备和质检收集培养第7d的DC细胞及CIK细胞按110比例共培养7,继续培养7d;在培养结束前,取样进行无菌试验检测,确认检测结果阴性后,在第14d收集细胞,其数量应达到1×1010个以上,台盼蓝染色检测细胞活力应在80%以上,同时采用流式细胞仪检测细胞免疫表型HLA-ABC、HLA-DR、CD3、CD4、CD8、CD11c、CD40、CD45、CD56、CD83、CD80和CD86等的表达;在患者使用前,取培养液用丫啶橙染色或革兰染色,追加一次污染检测。此外,对每一批细胞终制剂均要留样检测。3结语DC-CIK细胞过继性免疫治疗因其高效的杀瘤活性,被认为是最

15、有前途的肿瘤免疫治疗手段之一。DC与CIK共培养,构成了一个体外活化免疫体系,回输后能够有效地抵抗癌细胞对免疫细胞的抑制作用,发挥更持久的杀瘤活性,是主动特异性免疫治疗和过继免疫治疗相结合的典范。初步的临床试验证实了DC-CIK的安全性和有效性,但是其具体作用机制和长期疗效仍需进一步研究。随着DC-CIK细胞过继性免疫治疗的规范化和临床应用发展,DC-CIK细胞必将成为新一代过继细胞免疫治疗的最佳方法之一。参考文献:1Sabado RL,Bhardwaj N.Directingdendritic cell immunotherapy towardssuccessful cancer treat

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