通过响应面分析法优化超声提取泽泻中多糖以及测定其抗氧化性

1、通过响应面分析法优化超声提取泽泻中多糖以及测定其抗氧化性赵展翼a，张强b，李亚芳a，董路路a ,*，刘淑林a,c,*a哈尔滨医药大学药剂学学院，哈尔滨150081，中国b哈尔滨医药大学图书馆，哈尔滨150081，中国c哈尔滨医药大学基因组学研究中心，哈尔滨150081，中国关键词：泽泻，多糖，超声提取，响应面分析法，抗氧化性摘要：据报道泽泻（东方泽泻的根状茎）中的多糖（RAP）有许多重要的生物活性。然而，RAP的有效提取问题仍尚未解决，在此次研究中，笔者使用超声波对RAP进行高产量提取，并使用响应面分析法（RSM）优化实验条件。根据实验结果的多元回归分析，我们应用3-D响应面和等高线图来确定优

2、化条件，优化条件为超声波在76.1保持75.2分钟，水料比为 30.1ml/g。在这样的条件下，产量为6.9%，这远远高于传统的热水提取的产量（3.41%）。逐步乙醇沉淀的RAPs 表现出很强的抗氧化性。结果表明超声提取是一种非常高效的提取RAP的方法，并且多糖可以作为一种用于医药以及功能保健食品的潜在的抗氧化剂来研究。引言泽泻(RA)是东方泽泻(Sam)的根状茎。Juzep属于泽泻科，主要分布于中国，日本和印度（Han et al.,2013；Wu ,2005）。在古代中国的第一部药学著作神农本草经中，RA作为一种优质药材被记载（Gu ,2007)。作为一种民间药物，它用于治疗高血压，高血脂

3、和糖尿病（China, 2005; Li & Qu, 2012; Wu, 2005），并且作为传统中草药之一包含在药典之中（China ,2005)。最近，对RA的研究兴趣日渐高涨。因为据报道，它的许多成分比如三萜烯，泽泻醇B，特别是多糖具有重要的生物活性，包括抗HCV，抗炎，降血糖以及免疫效应（Han et al., 2013; Jiang et al.,2006; Lee et al., 2013; Li & Qu, 2012; Shimizu, Ohtsu, Tomoda,Gonda, & Ohara, 1994; Tomoda, Gonda, Shimizu,

4、& Ohara, 1994)。RAP因其对脂质的抗氧化有抑制作用而被记录，后者对人体健康具有潜在的重要性。然而，几乎没有关于有效提取RAP的研究。常见的方法比如通过热水，浸入以及索氏提取法，往往既费时又昂贵，而且所获得的RAP量极低，甚至会造成某些药理学作用的丧失(Li, Ding, & Ding,2007; Wang, Cheng, Mao, Fan, & Wu, 2009)。超声提取技术具有很多优点，比如相当高的提取量，温和的溶解环境，相对短的提取时间，等等，因此，已经被用于从植物材料中提取优质生物活性的多糖(Hromadkova &Ebringerova,

5、 2003; Hromadkova, Ebringerova, & Valachovic, 2002;Pan et al., 2010; Ying, Han, & Li, 2011 )。所以，超声提取技术被用来提高RAP的提取量而产生对生物活性最小的影响。为了将这种技术应用于RAP，我们用响应面分析法对提取环境和步骤进行了优化，响应面分析法是当多种因素和反应可能对提取量产生影响时优化反应过程的一个高效手段(Box & Wilson, 1951; PrakashMaran, Manikandan, Thirugnanasambandham, Vigna Nivetha,

6、&Dinesh, 2013)。响应面分析法的主要优势在于相当程度得减少了评价多元变量和它们之间反应可能需要的试验的次数，使得优化过程比其他方法更加简化。在此次研究中，基于单因子实验的结果，三个主要的影响因子（超声提取时间，水料比，超声提取温度）被用来优化超声提取RAP的实验条件。根据不同分子量的多糖在乙醇中有不同的溶解度，我们用逐步乙醇沉淀法获得了两种主要的多糖，它们都表现出强抗氧化性。1、 材料和方法2.1、材料 从黑龙江省采集的泽泻，从西格玛化工有限公司购买的DPPH，从西格玛-奥德里奇购买的葡萄糖，超纯水。2.2、RAP的提取和产量的确定 将干燥的RA用研磨机研磨成粉末(WND-

7、200, Weinengda Instrument Co., Ltd., Zhejiang, China),然后根据我们之前的工作，在60下用85%乙醇抽提三次，每次五个小时，去除脂质，色素，氨基酸，单糖和寡糖(Zhao, Xu, Ye, &Dong, 2013)。未溶解的部分通过过滤和干燥从溶剂中分离出来(60 C, 24 h)。接着在一个特定的超声提取时间，水料比和提取温度下，通过超声清除器利用经过最小程度修改的Zhao et al. (2013) 和 Prakash Maran et al. (2013)的方法将多糖从预先处理的干燥粉末中抽提出来。 上清液通过真空过滤从未溶解的残

8、留物中分离出来，接着用谢瓦格法处理(Jia et al.,2014; Sevag, Lackman, & Smolens, 1938)三次以去除蛋白质 ，然后集中透析两天去掉蒸馏水(cut-off Mw 3500 Da)。形成的溶液加入无水乙醇产生沉淀，最终浓度为80%，置于4下过夜。通过离心赫尔冻干将沉淀物收集起来获得RAP。用硫酸苯酚比色法以葡萄糖为标准测量糖含量(Balavigneswaran,Sujin Jeba Kumar,Moses Packiaraj,Veeraraj, & Prakash, 2013; Dubois, Gilles, Hamilton, Rebe

9、rs, &Smith, 1951 )。RAP的百分含量可以通过下列公式计算出来：含量（%）= ×100 (1)WP指的是多糖的质量，Wr 指的是原材料的质量2.3、实验设计、采用响应面优化法优化提取条 根据前期实验的结果(Fig. S1)，接下来的实验将选择三个主要的影响因子（超声提取时间，水料比，超声提取温度）。上述三个因子对RAP超声提取含量的影响通过单因子实验来研究，详细说，就是在一个特定的超声提取时间（从30到90分钟），水料比（从10到50ml/g ），以及超声提取温度（从50到80）下进行单因子实验。在每个试验中一个因子改变而其他因子保持不变。通过确定RAP的提取

10、含量来衡量每个因子的效应。件 在单因子实验结果的基础上，确定了每个因子的范围，一个具有三个变量（X1超声提取时间；X2水料比；X3超声提取温度）三水平的响应面设计被用来评价RAP提取的最佳条件。对于数据计算，上述三个值按照下述等式计算： i=1,2,3 (2)是变量的编码值，Xi 是变量的实际值，X0是Xi 在中心点的实际值，X是变化值。表1是单独变量的范围和水平。表2是BBD的实验序列。除了五个中心点外，每一个实验的进行都是三个重复，最后取多糖含量的平均值作为最终值。 为了预测优化条件，二次多项式适用于将独立变量和结果（多糖含量）的关系联系起来。 （3）表2 响应面优化法实验设计和泽泻多糖提

11、取量的结果操作编码的变量水平含糖量（%）aX1X2X31-1-103.9821-104.183-1104.8041103.555-10-14.75610-13.347-1015.0981015.4990-1-13.421001-13.26110-115.93120115.94130006.82140006.70150006.77160006.73170006.76a每个值都是三组测量值的平均值Y是预测值，Xi和Xj是自变量的编码值，0、i、ii、ij分别是拦截、线性、二次和交互的回归系数。每个实验设计所得到的值都服从多元非线性回归，这是用设计软件专家绘制的响应面图表。进行方差表的分析并确定了线

12、性、二元、交互的效果以及回归系数。模型的R2和调整后的R2值用来检测模型的准确性。后来在优化条件中进行额外的确定实验用来证明统计实验设计的有效性。认为当P值小于0.05时具有统计学意义。2.4 与传统热水提取的对比基于预实验的结果，预处理的干燥粉末在水浴中回流提取两次，提取时间120分钟，水料比30ml/g，提取温度75。根据2.2描述的步骤，可以获得RAP并确定提取量。为了研究不同提取方式造成的结构改变，FTIR分光光度计记录了两种方法（超声提取和热水提取）提取样本的傅里叶变换红外光谱。干燥的样品与溴化钾粉末研磨，压制成颗粒来进行频率范围从4000-400的 分辨率 最大源孔径 的光谱测量。

13、2.5 RAP的制备和分馏 通过上述2.2提及的方法对泽泻的经过前处理的干燥粉末进行提取，再通过初步乙醇沉淀的方法进行分馏，分馏的步骤如下所示：将无水乙醇缓慢加入提取溶液中使乙醇浓度在40%。混合溶液在4下过夜，通过离心和冻干收集沉淀(RAP)。随后将上清液加入乙醇使最终浓度为80%来沉淀(RAP)第二部分多糖。2.6 RAP的红外光谱和分子量 天然RAP、RAP和RAP的特征吸收峰可以由FTIR光谱辨别。天然RAP的粉末和它的纯化片段与溴化钾相混合、研磨并压制进行FTIR检测。步骤与2.4描述的相同。RAP、RAP和RAP的分子量由粘度计来测定。2.7 抗氧化活性的确定DPPH自由基清除活性

14、的测定 将前面所述的方法进行微小的修饰来测量DPPH自由基的清除活性。简言之，准备甲醇保存的0.1mM的DPPH溶液，取1ml该溶液加入3ml不同浓度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mg/ml）的多糖水溶液。将混合物重复混匀，在25下于暗处孵育30min。然后在517nm处测量吸光值。反应混合物的吸光值越低表明自由基清除活性越高。清除百分比可以由以下公式进行计算：清除活性（%）=A0-(A1-A2)/A0*100 (4)A0是空白对照（水而不是样本溶液）的吸光值，A1是样本的吸光值，A2是样本在与A1相同的条件下以水代替DPPH溶液的吸光值。自由基清除活性的测定 根据之前描述的芬顿法

15、，经过最小限度的改进来测定羟基自由基的清除活性。将样本溶解于蒸馏水中形成最终的浓度梯度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mg/ml），并与9.0mMFeSO4(1.0ml),0.3%H2O2(1.0ml)以及0.5ml的水杨酸乙醇溶液共同孵育（37,30min）。每管混合物的总体积通过加入一定量的蒸馏水而达到10ml。以空白管作对照在510nm读混合物的吸光值。羟基自由基的清除活性可以通过以下公式计算：清除活性（%）=(A0-A1)/A0*100 （5）A0 和A1代表空白对照组和实验组在510nm的吸光值。 超氧阴离子自由基清除活性的测定在弱碱性条件下，超氧阴离子自由基在邻苯三酚自氧

16、化过程中产生。对先前所述的方法进行微小改进来测量超氧阴离子自由基的清除效应。简单来说，就是将不同浓度的样本（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mg/ml）与50mMTris-HCl缓冲液在25下共同孵育20min，然后在相同温度下加入25mM邻苯三酚，使反应进行5分钟，随后快速加入1ml8mMHCl终止反应。在299nm测量其吸光值。超氧阴离子自由基的清除活性可以通过以下公式计算：清除活性（%）=（A0-A1）/A0*100 (6)A0是不加样本的吸光值，A1是加样本的吸光值。溶血抑制活性的测定本实验通过将实验方法进行微小的修改来进行。在实验中，我们遵循美国国立医学网站和哈尔滨医科大学动

17、物伦理委员会出版的实验动物保健和使用指南这本书的指导。体重在150-200g之间的成年雄性大鼠来自隶属于动物实验管理委员会的哈尔滨医科大学动物研究中心。环境温度控制在22-24之间，50%的相对湿度和12小时的光暗周期，给所有大鼠都提供食物和水。简言之，就是从健康大鼠体内提取2.0ml血液装进含有肝素的离心管中，立即在2500转下离心5min以获得红细胞。在4下将红细胞在生理盐水中清洗三次，再在生理盐水中重悬以获得2%的红细胞悬浮物。将不同浓度的实验样本（0.1、0.5mg/ml）与红细胞和双氧水（7.5mM）在37和5%CO2存在下共同孵育三个小时，空白对照（生理盐水代替样本溶液）以同样的方

18、式处理。孵育结束后，取出0.2ml的孵育混合液用4.0ml的生理盐水溶解，并在2500转下离心5min。用荧光分光光度计在540nm处测量上清液的吸光值（A）。取相同体积的混合液加入4.0ml冰冷的蒸馏水以获得完整的溶血反应，并在相同的波长下读取吸光值（B）。红细胞溶血率可以通过(A/B)*100计算。2.8 统计学分析所有实验都做了三个重复，显示的数据是这些独立实验的平均值。使用设计专家软件对响应面法进行统计学分析。对于多重比较可以使用方差分析的方法，当p值<0.05时，认为具有统计学意义。3 结果和讨论3.1 单因子实验 在这部分，我们分别研究了超声提取时间，水料比和提取温度。单因子

19、实验的结果如图一所示。时间对多糖产量的影响超声提取时间是多糖提取的一个重要参数。在本实验中，分别设置提取时间为30,45,60,75和90min来研究当其他参数相同时时间对多糖产量的影响，其他参数的设置如下：水料比为30ml/g，提取温度为70。根据图1a,多糖产量随着提取时间的增加而提高。这个结果表明较长的超声提取时间对RAP产量具有积极的影响。这可能是因为暴露RAP到能使液体穿透原材料的释放介质中，溶解RAP并最终使RAP从原材料中扩散出来的时间要求的原因。75min后，超声提取时间越长，多糖产量的增加越缓慢，这意味着随着提取时间的增加多糖产量将保持一个动态平衡。这可能是因为植物细胞中的多

20、糖已经被充分提取了。对多糖产量的影响 许多研究表明不同水料比将显著影响多糖产量。在本实验中，当其他参数相同时水料比分别设置为10,20,30,40和50ml/g，其他参数的设置如下：超声提取时间为60min，提取温度为70.如图1b所示，多糖产量随着水料比的增加而增加，当水料比为30ml/g时达到最大值。这是因为水料比越大植物细胞内外溶剂的浓度差越大，并导致多糖大量运输的动力增加。但是在30ml/g之后曲线趋于平缓，这意味着水料比再增加都不会提高多糖的提取量。这可能是较高的水料比延长了扩散到组织内部的距离的原因，对产物收集造成了很大损失。提取温度对多糖产量的影响如图1c所示，研究了超声提取温度

21、对多糖产量的影响。提取过程分别设置温度为40,50,60,70和80，其他参数设置如下：提取时间为60min，水料比为30ml/g。图1c表明当温度从40增加到70时产量显著提高，并达到顶峰（5.30%）。超声提取温度的积极影响可以用多糖在溶剂中较高的溶解度，较高的扩散率以及高温促进运输来解释。当温度继续上升时RAP产量开始减少。一种可能的解释是高温下多糖可能被水解。这个趋势与其他之前的研究有很好的吻合。根据单因子实验结果，我们调整RSM实验超声提取时间为60-90min，水料比为20-40ml/g，超声提取温度为60-80。3.2 通过BBD进行提取条件的优化 如表2 所示，完成了设计矩阵中

22、的每个实验并得到了实验数据。利用设计专家软件通过多元回归分析对数据进行分析得到了下列多项式方程：Y=6.760-0.258X1+0.005X2+0.960X3-0.363X1X2+0.453X1X3+0.043X2X3-1.301X12-1.331X22-0.791X32 (7) F检验和p值被用来衡量表3所示的模型和结果的回归系数的显著性。如果绝对F值越大p值越小，则相关变量越显著。二元回归模型的方差分析表明该模型极显著（p=0.0002），结果显示该模型适用于预测范围之内使用的变量。同时可以看到对RAP产量具有显著效应的变量是线性的（X3），二次的(X1*X1，X2*X2,X3*X3)以及

23、X1和X3的交互。如表3所示，决定系数（R2）和变异系数分别是0.9966和3.53%，这表明多项式模型方程具有高的配合等级，好的精度和可靠性。通过设计专家软件绘制响应面来解释变量之间的相互作用并确定每个变量获得最大响应频率的最优水平。如图2和图3所示是三维响应面和二维等高线。每个数字都表示当另一个因子处在零水平时其他两个因子对多糖产量的效应。图2a和图3a的3-D图和等高线图设置超声温度为零水平，图显示在最初阶段随着超声提取时间和水料比的增加多糖产量液随之提高，随后缓慢降低。图2b和3b是在不同的提取时间和提取温度下的3-D图和等高线图。从这些数字可以看出多糖产量随着提取温度和提取时间的增加

24、而提高，但是当提取温度继续增加时多糖产量不会随之提高。结果与单因子实验和方差分析一致。当提取时间处于零水平时，自变量水料比和提取温度为基础的3-D图和等高线图如图2c和3c所示。水料比和提取温度的引起的多糖产量的变化趋势与上面提及的相似。用设计专家软件进行响应面分析来确定最优提取条件。最优提取条件分别是超声提取时间为75.2min，水料比为30.1ml/g，超声提取温度为76.1，RAP的最大预测产量是7.05%。3.3 模型检验 使用挑选的最优条件来检验预测最优响应值的模型方程的适用性。在优条件下，实际实验的得到的均值为6.90%，证明了提取模型的验证。这些结果之间好的相关性印证了该模型足够

25、反映期望的最优化条件。3.4 与传统热水提取的对比与传统热水提取相比较，超声提取的应用积极地影响了RAP的产量（表4）。与热水提取相比提取时间极大地缩短。这是因为超声波辐射可以促进提取进程，可能促进生物活性物质的提取。超声提取应该是一项合适且高效的从泽泻中提取多糖的技术，这一点是确定的。为了证明超声提取和热水提取对多糖官能团的影响，记录了两种方法提取的红外光谱。如图4a和d所示，在3435cm处有一个宽且强烈的由两种不同方法提取的多糖吸收峰，这归因于羟基。在2900-3000处出现了一个微弱的-CH拉伸峰。1600-1700处的强烈吸收峰归因于羰基。1400处的峰是羧基出现的迹象。根据红外光谱

26、分析，由两种方法提取的多糖官能团基本是相同的。3.5 RAP的红外光谱和分子量 图4a-c可以看到，RAP,RAP和RAP的红外光谱基本上是没有区别的，仅仅在带的亮度上有一些差异。在3600-3200,3000-2800，1250-1000范围内的吸收带是多糖的特征吸收峰，这同样可以在葡聚糖的红外光谱中看到。这些结果说明RAP与葡聚糖具有相同的主要结构和相似的典型官能团。在3435左右的强烈吸收峰属于羟基的伸缩振动。2980和1390左右的微弱峰是C-H键不对称振动造成的。1630处的带是C=O双键不对称伸缩振动吸收峰。在1000-1200区域有一个强烈的广泛吸收峰，是因为在光谱中观察到了C-

27、O-C和C-OH侧链基团。另外，850的特征带是由于型糖苷键的原因。RAP,RAP和RAP的分子量分别是118.92kDa，140.39 kDa，103.13 kDa。3.6 RAP的抗氧化活性自由基的清除活性DPPH自由基是一种比较稳定的自由基，在抗氧化剂存在时接受电子或氢而被清除，被广泛用来评价抗氧化剂的自由基清除活性。图5a描述了不同浓度的多糖样本的DPPH清除能力。所有样本的DPPH清除活性均表现出明显的浓度依赖性。但是当样本浓度高于0.4mg/ml时，清除能力没有明显的增加。RAP比其他样本表现出了更强的DPPH清除能力，RAP和RAP的DPPH清除能力没有明显的差别。许多因素影响抗

28、氧化剂对DPPH的清除效应，一些文章报道单糖单元的羟基能贡献质子来结合DPPH的未配对电子，以形成非基DPPH-H。自由基的清除活性羟自由基是危害最大的活性氧之一，它能够轻易地穿过细胞膜与包括碳水化合物、蛋白质、脂质以及指导细胞凋亡的DNA在内的生物分子发生反应。因此清除羟自由基对于保护生命系统非常重要。羟自由基的清楚活性如图5b所示。在相对低的浓度条件下（<0.2mg/ml）清除效应随着样本浓度的增大而增高。这个结果证明所有RAP样本都具有潜在的清除羟自由基的抗氧化能力。当清除能力达到平台期，RAP的清除能力最低，RAP和RAP的清除能力相似。抗氧化剂对羟自由基的清除效应可能是由于存在于多糖中的羟基，它能够贡献出氢原子来结合羟自由基以达到清除效果。阴离子自由基的清除活性超氧化物阴离子自由基是一种弱氧化剂，但是它能够持续降解而形成其他活跃的