李建华老师课件

1、液相色谱仪日常维护及维修上海市药检所化学室李建华液相色谱仪结构组成 流动相 脱气机 泵 进样器 柱温箱 柱后衍生化装置 检测器流动相试剂 有机相：光学纯或有机相：光学纯或HPLC级级 水：必须是新鲜的去离子水水：必须是新鲜的去离子水 其它试剂：分析纯或更高其它试剂：分析纯或更高注意：使用前均用相应的滤膜滤过（注意：使用前均用相应的滤膜滤过（0.45m）溶剂使用注意点滤膜 聚四氟乙烯膜聚四氟乙烯膜-双相双相 尼龙尼龙66膜可过水和大多数有机溶剂膜可过水和大多数有机溶剂 醋酸纤维素滤膜适用于水性溶液（尤其是蛋白质和蛋白质醋酸纤维素滤膜适用于水性溶液（尤其是蛋白质和蛋白质相关样品）相关样品） 再生纤

2、维素滤膜适用于水溶性生物样品和有机溶剂。再生纤维素滤膜适用于水溶性生物样品和有机溶剂。注意：注意：1.水膜和有机滤膜千万不可混用！水膜和有机滤膜千万不可混用！2.分别滤过的水相与有机相的混合。分别滤过的水相与有机相的混合。溶剂过滤器检查溶剂过滤器清洗 垂熔玻璃滤器： 不锈钢烧结滤器：可用超声清洗流动相脱气 脱气作用脱气作用 脱气方式原理：脱气方式原理：1. 低压脱气低压脱气2.氦气脱气氦气脱气3. 超声波脱气超声波脱气流动相脱气作用流动相脱气方式1低压脱气法 电磁搅拌水泵抽空，可同时加温或向溶剂吹氮。由于抽空和加温都会导致溶剂蒸发，对二元或多元洗脱液的组成会有影响，故此法适用于单一组成的洗脱液

3、。2氦气脱气法 将氦气通过一圆筒过滤器通入冲洗剂中，在o5kscm2压力下保持10一15min，用氦气的小气泡将溶于溶剂中的空气带出。此法简单方便，适用于所有洗脱液，只是氦气较贵。3超声波脱气法 将洗脱液瓶置于超声波清洗槽中，以水为介质超声脱气。一般500m1溶液约需20一30min。此法方便，适于采用。三种脱气方式比较脱气方式脱气效果能否在线对基线漂移影响氦气脱气好能噪音较低，易基线漂移超声脱气一般（需加真空）不适合/真空脱气较好能噪音、基线漂移均较小在线脱气应用细节 氦气脱气：氦气起始流速一般设置30ml/min左右，维持时间根据流动相体积来确定，分析时维持流速一般设置5ml/min左右。

4、 真空在线脱气：脱气机每个通道的流动相相对固定，这样可避免相互干扰。更换溶剂排液要充分，并且要注意脱气机最大流速。真空脱气机联接真空脱气机工作原理脱气机维护 溶剂过滤器清洗 溶剂更换 不用通道溶剂更换或封堵 排液时要根据脱气机类型选择流速、时间。注意：由于大部分连接头和注意：由于大部分连接头和 芯子都是塑料的，拧紧时千万不芯子都是塑料的，拧紧时千万不可太用力。可太用力。脱气机故障脱气机故障原因判断 真空泵故障：短接真空泵进、出口管路 真空腔漏 连接密封性 溶剂 半透膜破裂泵 分类：1.作用原理2.输液方式 应用：单元泵多元泵：1.低压混合：比例阀2.高压混合：混合器液相色谱的溶剂输送系统恒压泵

5、恒流泵气动放大泵注射泵单柱塞泵双柱塞泵隔膜泵并并联联泵泵串串联联泵泵色色谱谱泵泵溶剂A溶剂B电磁阀A电磁阀B混合室泵溶剂A溶剂B高压泵A 高压泵B混合室低压、高压混合比较低压混合四元泵工作原理低压混合四元泵结构Agilent 1100泵结构密封垫冲洗装置密封垫冲洗应用泵应用细节 使用的流动相要与泵的压缩因子配对。特别是用使用的流动相要与泵的压缩因子配对。特别是用梯度混合时。梯度混合时。 对四元泵比例阀来说对四元泵比例阀来说,密度大的流动相放下方密度大的流动相放下方（常规是水相溶剂应放在下方（常规是水相溶剂应放在下方,有机溶剂放在上有机溶剂放在上方）。方）。 二元或四元泵的冲程调小可获得较好的混

6、合效果，二元或四元泵的冲程调小可获得较好的混合效果，但会影响密封垫寿命。但会影响密封垫寿命。 梯度或比例阀的准确性可测定。梯度或比例阀的准确性可测定。泵维护泵维护不同用途时溶剂选择目的溶剂注释安装后异丙醇排除系统中空气效果最好正相与反相间转换异丙醇与两相溶剂互溶性均较好安装后甲醇或乙醇如没有异丙醇，可代替（第二种选择）使用缓冲液后冲洗系统重蒸水再溶解缓冲液结晶效果最好更换溶剂后（反相）重蒸水防止缓冲液结晶析出正相密封垫安装后异丙醇-己烷（5：95）润湿效果好液相泵后常用在线过滤器带可更换滤芯的在线过滤器图例带可更换滤芯的在线过滤器图例Sample FilterSolvent FilterFil

7、ter Element样品过滤器溶剂过滤器过滤器元件泵维护 多通道梯度阀 进、出口单向阀清洗 出口过滤阀清洗或更换 Seal Wash的清洗及密封垫更换 泵密封垫更换 石英柱塞杆清洁、更换维护信息密封圈拆洗泵密封圈更换泵密封圈更换泵密封圈更换注意点：泵密封圈更换注意点：1.柱塞用牙膏棉球擦洗一下。柱塞用牙膏棉球擦洗一下。2.密封圈在甲醇中浸泡密封圈在甲醇中浸泡5分钟用专用工具安装。分钟用专用工具安装。3.泵座用水清洗一下。泵座用水清洗一下。4.密封圈（注意不同类型）密封圈（注意不同类型）密封垫磨合常见泵故障和诊断 多通道梯度阀漏 泵前出现气泡 压力不稳 泵不出流动相（松开purge阀） 进、出

8、口单向阀漏或堵塞 压力高泵压力不正常原因 气泡 进、出口单向阀故障 密封垫或柱塞杆磨损 管路渗漏或堵塞 比例阀故障 压力传感器故障 比例阀混合盐浓度太高进样器 手动进样器：1.垫塞进样 2.阀进样 自动进样器：Manual Injector Valves - Six Port Fixed LoopToWasteSample Loop(Fixed Volume)FromPumpToColumnSampleSyringeLoadInjectToColumnCommon ProblemsnImproper syringe size or typenValve BlockagenInjection-p

9、ort leakagenSample carryovernCross-port leaksFront ViewInjectRear ViewLoad - InjectSample Loop手动进样器操作原理手动进样器操作原理手动进样器 手动进样器：六通阀 进样顺序：INJ时插针，LOAD时注射，再加INJ时运行 排空管翘起高度要与针口平行 六通阀接口最好用Rheodyne专用接头，减少死体积 若用定量管来定量，则多进样（定量管体积1.5倍以上） 转子密封圈若漏，可先将三个定位螺丝拧紧5-10度（如无效再更换转子） 在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧

10、贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。尽快转动阀，不能停留在中途，否则过高的压力在柱头上引起损坏。 六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20l的定量环最少进样60至100l的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。 六通阀的使用手动进样器维护 防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通

11、常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗，。手动进样器维护手动进样器维护手动进样器维护转子密封垫选择Agilent 1100自动进样器工作原理Agilent 1100自动进样器工作原理自动进样条件优化进样污染处理进样污染处理自动进样器维护 进样座与针外壁要在诊断中的进样座与针外壁要在诊断中的change needle状态下，状态下，用水棉球及异丙醇棉球擦洗。用水棉球及异丙醇棉球擦洗。 若常用缓冲溶液，计量泵内的柱塞与密封圈，六通阀上若常用缓冲溶液，计量泵内的柱塞与密封圈，六通阀上的定子与转子密封圈要定期清洗。的定子与转子密封圈要定期清洗。 若六通

12、阀的转子密封圈有划痕，可将三个固定螺丝各拧若六通阀的转子密封圈有划痕，可将三个固定螺丝各拧紧紧5到到10度。度。 机械部分要保持清洁，若有灰尘需取出机械臂，除尘并机械部分要保持清洁，若有灰尘需取出机械臂，除尘并加稀牛油。加稀牛油。 定量环要在定量环要在Configure中定义，如中定义，如100ul、500ul、900ul、1500ul。自动进样器维护 更换针及针座 更换转子密封圈转子密封圈磨损判断：自动进样器常见故障柱温箱 连接头、管线 预热器 柱温箱 色谱柱HPLC连接用的接头连接用的接头零死体积接头零死体积接头不能使用的接头不能使用的接头HPLC常用的色谱柱接头常用的色谱柱接头0.090

13、 in.0.130 in.0.090 in.0.170 in.SwagelokWatersParkerRheodyneValcoUptight0.090 in.0.080 in.Troubleshooting LC Fittings, Part II.J. W. Dolan and P. Upchurch.LC/GC Magazine 6:788 (1988)连接管线 柱温箱维护柱温箱维护 进出柱温箱的管路一定要嵌入槽口内，以免折断管路。进出柱温箱的管路一定要嵌入槽口内，以免折断管路。 予热器要定期清洗，以防污染及堵塞。予热器要定期清洗，以防污染及堵塞。 拆卸柱子要用两个板手，以免毛细管折断。

14、拆卸柱子要用两个板手，以免毛细管折断。 使用使用peek管，要注意压力不要超过管，要注意压力不要超过200bar，否则管子会弹出。，否则管子会弹出。 温度设置比室温低时，要注意有水冷凝析出。温度设置比室温低时，要注意有水冷凝析出。色谱柱分类 预柱： 分析柱预柱液相色谱的预柱按其安装位置可分为两种。 一种是安装在泵和注射器之间，目的是使校免受腐蚀性的或受污染了的流动相的损害。腐蚀性的流动相逐渐溶解预柱卞的硅胶填料，使其在到达分析柱之前就已变得饱和因此不损害分析拄。另一方面，预柱可用来收集流动相中的痕量杂质。在注射口前收集杂质比在注射口后往前)收集杂质好，因为在后一种情况下，有可能改变柱的选择性或

15、产生鬼峰-在有梯度系统的情况下，这种预柱可放在泵的出口，混合槽的前面，达一类预拄的填料部宜有一定的容量并易于填充。 另一种预柱安装在注射口和分析柱之间，这种预柱主要用来防止脏的样品和已损坏的垫或其它材料进入分析柱。这种预柱是要通过样品的，所以与第一种不同，要求较高，它必须填充得很好，柱效较高，并且在功能上能和分析往匹配。另外，不管是和注射口的联接还是和分析柱的联接，都要注意尽量减少死体积，因为它是分析柱的一个延伸。预柱和保护柱预柱和保护柱由泵输送的流动相预柱进样器保护柱分析柱至检测器截留或浓缩柱 色谱柱的安装Whats needed:The right connectors to avoid

16、any future leak. Guard column to protect the main column The right tools 标准不锈钢分析柱CapillaryS.S. Filter Frit 2 um Pore SizeColumn PackingAuthoring Division Name File NameSecurity Notice (if required) 卡套柱：带可重复使用的末端卡套柱：带可重复使用的末端接头和一体化的保护柱柱芯接头和一体化的保护柱柱芯无保护卡套柱芯无保护卡套柱芯有保护卡套柱芯有保护卡套柱芯带带Techtron 卡套柱芯的卡套柱芯的Zor

17、bax 保护柱保护柱Techtron 柱芯柱芯含一体化的滤芯含一体化的滤芯min5101520253035mAU140142.5145147.5150152.5155157.5160min5101520253035mAU140142.5145147.5150152.5155157.5160BDS ODS Hypersil 250 - 2 mm with integrated Guard ColumnBDS ODS Hypersil 250 - 2 mm without Guard Column2 mm 内径卡套柱有和无保护柱的比较内径卡套柱有和无保护柱的比较高效液相色谱柱发展史高效液相色谱柱发

18、展史19世纪70年代中期，HPLC仪开始出现，主要填料：10 m 的无定型硅胶颗粒。70年代后期，发展了反相液相色谱。80年代，HPLC 被广泛应用于化合物的分离，主要填料：粒径为5 10 m 球形硅胶。90年代早期，粒径为 5 m 的高纯硅胶，即所谓的 B 型硅胶被发展，并成为这个行业填料的标准，这种 B 型硅胶含有微量的金属。90年代后期，为了满足快速分离的需求，发展了 3 m 或 3.5 m 的球形硅胶，其作用和性能逐渐的获得了人们的认同和接受。21世纪早期，为适应超快速的分离要求，粒径小于 2 m 的填料被开发出来，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。目前，市场上流行的分析用的 HPL

19、C 硅胶基质填料主要为 B 型硅胶。硅 胶基质材料目前应用最为广泛的基质材料。高机械强度和高的比表面积。可利用直接的广泛的表面键合反应来满足正相、反相、离子交换、疏水作用色谱和体积排除色谱的需求。高效。重现性好。pH 适用范围为pH 28。具有容易导致强碱性物质拖尾的，表面活性和带酸性的硅羟基。聚合物基质材料交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。 pH 稳定性好：pH 1 13。可以在很宽的范围内进行表面化学处理以满足反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求。在中等 pH 条件下对强碱性物质具有更好的峰形。填料的体积随着流动相的不同而改变，如膨胀或收缩。分离效率相对硅胶而言比较

20、低重现性不好硅 胶 外 形球形硅胶: 现代 HPLC 填料粒径小 (5 m, 3 m, 5 m柱床稳定性差比表面积较小价格便宜硅 胶 纯 度 硅胶纯度对强极性化合物的分离最重要。 以前的纯度较低的硅胶（称为 A 型硅胶）, A 型硅胶是以金属硅酸盐制备而来，具有很高的金属含量，可被用作中性化合物和非离子化合物的分离。 纯度高、酸性较弱的硅胶 (称为 B 型硅胶)，这种硅胶是以无金属的工艺制备而来，只含有微量的金属，建议用于分离离子化合物和可电离的化合物，特别是碱性化合物。 金属杂质引起对螯合剂和碱性化合物的分离产生不对称峰或拖尾峰。硅胶纯度M+表面金属能与螯合化合物络合 M Si OH 内部的

21、金属对表面硅羟基具有活化作用强酸性A 型硅胶 C18B 型硅胶C18硅胶孔径孔径作用和效能 60 nm对 HPLC 分析没有用，会引起峰形拖尾和较低的分离效率60 150 nm对小分子的分离效果理想 (MW 1,000 nm对聚合物的分离效果理想，如DNA和生物大分子硅 胶 粒 径粒 径作 用 和 效 能5 m目前应用最广泛，可以满足从分析到半制备的分离3 3.5 m常用于分析柱上的快速分离，色谱柱短，节省溶剂 2 m常应用于超快速分离， high throughput, 分离度高7 10 m常用于半制备色谱柱10 20 m常用于制备色谱柱HPLC 色谱柱结构类 型内径D (cm)柱长(cm)

22、粒径 (m)分析柱0.3 0.463 - 253 - 10微孔柱0.1, 0.2115, 253 - 8半制备柱0.8 1.010 - 255 - 20制备柱2.0 5.010 - 255 - 20键 合 相 键合相: 反相: 70%; C18, 65%; C8, 15%; Cyano, 5%, 苯基柱 1.2NormalTailingNormalTailing可能的原因:有些峰拖尾二次保留效应，残留的硅羟基影响二次保留效应，残留的硅羟基影响在大峰的尾部有小峰流出在大峰的尾部有小峰流出柱头处有交叉污染柱头处有交叉污染金属影响金属影响所有的峰都拖尾柱外效应柱外效应柱已损坏柱已损坏样品量或溶剂不合

23、适样品量或溶剂不合适柱过载，偶尔发生吸附曲线是反langmuir型色谱柱故障诊断色谱柱故障诊断- 峰形问题可能的原因柱过载，偶尔发生柱过载，偶尔发生小峰在大峰前流出小峰在大峰前流出NormalFronting伸舌峰对称系数 硼酸盐硼酸盐 有机溶剂有机溶剂溶解速度增加随溶解速度增加随:柱压升高 A 检查有无色谱柱时的压力：应分段检查；大多数情检查有无色谱柱时的压力：应分段检查；大多数情况下问题出在系统和保护柱上。况下问题出在系统和保护柱上。 A 如果确定是色谱柱的压力高：如果确定是色谱柱的压力高：B 冲洗柱冲洗柱 -除去柱污染物；大分子化合物；从样品和除去柱污染物；大分子化合物；从样品和缓冲溶液

24、带来的污染物缓冲溶液带来的污染物 B 反冲柱压力高反冲柱压力高-清洗柱入口滤片清洗柱入口滤片 （20%硝酸水溶液硝酸水溶液-水）水） 色谱柱的清洗 以下溶剂每种至少25 mL（25cmx4.6mm)反相色谱柱的冲洗用比流动相强度大的溶剂反相色谱柱的冲洗用比流动相强度大的溶剂 不含盐的流动相不含盐的流动相 100% 甲醇甲醇 100% 乙腈乙腈 75% 乙腈乙腈:25%异丙醇异丙醇 100%异丙醇异丙醇 100%二氯甲烷二氯甲烷* 100% 正己烷正己烷* When using either Hexane or Methylene Chloride the column must be flus

25、hed with Isopropanol before returning to your reversed-phase mobile phase.色谱柱的清洗 每种溶剂至少用每种溶剂至少用 50 mL ； 50% 甲醇甲醇 : 50% 氯仿氯仿 100% 乙酸乙酯；乙酸乙酯；100%所用流动相（正己烷等所用流动相（正己烷等）正相流动相的选择正相流动相的选择增强溶剂的强度增强溶剂的强度l在色谱柱安装前、后测试压力差l如果柱两端的反压很高，反接色谱柱，再用10-20倍柱体积的流动相冲洗柱体后，再测试压力差l如果出现沉淀， (如：蛋白质凝聚，细胞物，聚合物)设法用相应的可溶性溶剂，如0.1% TF

26、A / 80% 乙腈, 6M 盐酸胍, THF, HFIP等清洗以除去堵塞物l若仍无效，应考虑更换过滤片色谱柱的修复和再生色谱柱的修复和再生-物理性阻塞柱进样口柱进样口滤片滤片密封垫圈密封垫圈柱体柱体Female End FittingMale End Fitting操作注意事项：操作注意事项：l带手套带手套l填料不能变干填料不能变干l不要接触色谱柱体不要接触色谱柱体 l加热填料会被挤出加热填料会被挤出l不要拧得过紧不要拧得过紧色谱柱故障诊断色谱柱故障诊断更换进样口滤芯更换进样口滤芯由于键合相水解或硅胶溶解而造成的色谱柱填料变化是不可逆的l 由于污染而产生的色谱柱变化可以通过适当的洗清使之修复

27、l 梯度洗脱的方式 (水 - 强有机溶剂) 通常最有效l 低 pH 流动相, 如 0.1% TFA 或 0.01M H3PO4, 也是有效的l 适当升高温度也有帮助 (60-80C)色谱柱的修复和再生色谱柱的修复和再生-化学变化-Il某些溶液，如6M盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素可用于清除蛋白质的沉积l某些填料 (XDB, 有机聚合物)，可使用高pH 水/有机溶液，如：0.01M NaOH溶于50%异丙醇/水溶液。 硅胶基质应尽量减少接触时间 (15-30 min)。色谱柱的修复和再生色谱柱的修复和再生-化学变化-II例子：4.6 mm ID x 15 cm Zorbax 300SB-C18流速:

28、1 mL / min; 温度: 80CA: 0.1% TFA 水溶液 B: 0.1% TFA 乙腈溶液100% A for 30 min.; 0-100% B over 30 min.; Hold 100% B for 30 min., Return to 100% A in 5 min.重复3次色谱柱日常维护(1)每日开机时，流速和柱压要逐渐增加，突然迅速增加，会使柱床受到冲击，引起紊乱，产生空隙。(2)在注射样品前要使色谱系统平衡，是否平衡可由基线加以判断。(3)在注射样品前，用手摸一下色谱系统的各个接头，通常由此能发现柱是否有漏；漏得不严重时，可以用皮肤是否有冷感加以判断。空气会从漏缝进

29、入系统引起基线漂移，影响峰高和峰面积的重复性。 (4)不要把柱接头拧得太紧。上得过紧容易损坏接头螺纹，引起渗漏。拧螺丝时使用的扳手应短一些，不宜太长。色谱柱日常维护(5)不要把柱子放在有气流的地方或直接放在强光下，气流和阳光都会使柱子产生温度梯度，造成基线漂移，如果怀疑基线漂移是由温度梯度引起的，可以设法使柱子绝热或恒温，也可用布(或毛巾)把柱和接头包起来。 (6)如果仪器用来做常规分拆，样品种类有限，但分析次数很多，则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。 (7)如果所注射的样品会污染柱子，可以用合适的溶剂(几百毫升)慢慢冲洗柱子过夜，第二天早晨再用流动相重新平衡校子

30、(约30分钟)。(8)在因装卸、更换、贮存等而挪动柱子时，动作要轻，不要使其受到碰撞，以免柱床因震动产生空隙或通道。(9)柱要加标签，新旧分开，不要放在温度变化很大的地方。 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；色谱柱维护色谱柱的良好使用规范溶剂使用前必须过滤溶剂使用前必须过滤避免使用高粘度的溶剂作为流动相避免使用高粘度的溶剂作为流动相运输中变干了的

31、色谱柱，使用时要完全浸湿运输中变干了的色谱柱，使用时要完全浸湿了解样品溶剂对溶解度及分离的影响了解样品溶剂对溶解度及分离的影响进样样品要提纯，如果样品中含有无需考虑而保留强的进样样品要提纯，如果样品中含有无需考虑而保留强的组分时组分时, ,必须进行前处理必须进行前处理严格控制进样量严格控制进样量清楚了解色谱柱填料适用的清楚了解色谱柱填料适用的: pH: pH范围，温度，化学适应范围，温度，化学适应性性色谱柱的良好使用规范当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净避免操作不当损坏色谱柱避免操作不当损坏色谱柱, ,如如: :猛敲猛敲, ,跌落或过紧

32、拧接头跌落或过紧拧接头定期用强极性溶剂冲洗色谱柱定期用强极性溶剂冲洗色谱柱使用新鲜的水溶液使用新鲜的水溶液, ,要注意使用生物稳定剂要注意使用生物稳定剂, ,如叠氮化钠如叠氮化钠每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭柱子维护卸下柱子和入口接头，可看到接头孔隙。如果柱头孔隙深度小于1厘米，可以来用下述局部重装的办法，否则，柱应当完全重装或更换。 柱入口局部重装时采用的填

33、料可以和柱内原有填料一样，也可以用玻璃珠。 粒子大于20微米的可以用敲打充填法干装。如果小于20微米则要用合适的溶剂配成淤浆，淤浆逐次加入，每次加入前都要使上一次加入的全部沉降。把孔隙填满后，用一把刮刀将续料刮乎更换柱入口接头，把柱重新接到液相色谱系统中，慢慢地增加流速和系统压力，直到操作上限为止。让相当于l0一20倍柱体积的流动相通过柱子，然后逐渐降低柱流速，并使压力降为零，再把柱子卸下来，并卸下入口接头，观察柱的入口，此时孔隙应当减小，但是由于新加入的填料在系统的操作压力下压缩柱头，孔隙不可能一次就被全部充满。重复上述局部至装过程，直到柱上加不进更多的粒子为止。一旦柱子填充完毕，可加进混合

34、样品，测定柱子的性能是否已经改善。柱维护 对于严重污染的反相住，也可采用这样的办法：用泵依次打入水甲醇-二氯甲烷-己烷，然后把此顺序倒过来再打一遍，最后到水，不接检测器。 如果分析类脂化合物，也可使用易溶解油脂的溶剂如50ml二氯甲烷然后是50毫升甲醇。 其它有机物，如乙醚、四氢呋喃和二甲基亚砜也能用来清洗反相柱。另外也可使用络合溶剂如EDTA二钠等。 在任何洗涤中，升高温度都能加速杂质的溶解。检测器 紫外检测器紫外检测器 示差检测器 荧光检测器 电化学检测器 电导检测器 蒸发光散射检测器 质谱液相色谱的检测模式液相色谱的检测模式示示差差折折光光电电导导紫紫外外荧荧光光电电化化学学响响应应通用选择性选择性选择性选择性灵灵敏敏度度毫克纳克纳克PicogramPicogram线线性性范范围围流流速速敏敏感感是是否否是温温度度敏敏感感是是否否是梯梯度度淋淋洗洗不可有限制可以可以脉冲的可以104106105