肇庆学院生命科学学院生物实验技能决赛实验设计书——珍稀药用植物金线莲质量测定的初步研究

1、肇庆学院生命科学学院生物实验技能决赛实验设计书参赛作品题目珍稀药用植物金线莲质量测定的初步研究参 赛 者 资 料姓名性别班级长短号XXX男XXX女XXX女XXX女 珍稀药用植物金线莲质量测定的初步研究摘要：以金线莲为试验材料, 通过测重法测定生物量与含水量、蒽酮比色法测定可溶性总糖的含量，对评价其质量做初步探讨，同时为金线莲进一步研究与开发提供一定参考意义。关键词：金线莲 生物量 含水量 可溶性糖 测定金线莲Anoectochilus roxburghii(wall.) Lindl为兰科开唇兰属（Anoectochilus）多年生草本植物，又名花叶开唇兰、金线兰，是我国传统珍贵药材，素有“药王

2、”、“金草”、“神药”和“乌人参”等美称1。据研究报道，金线莲中氨基酸组成、成分含量及抗衰老活性微量元素的含量均高于国产和野生西洋参2，且富含有多糖、强心苷类、有机酸、甾体化合物、黄酮类化合物、生物碱等3-5等多种成分，广泛应用于风湿性关节炎、高血压、糖尿病、肾病和尿血等症状的治疗，以及病后体虚恢复等方面，被称为“药中之王”3,4。此外，金线莲还是的一种室内观叶珍品。目前，金线莲的质量标准尚未被制定，较统一的意见为市售金线莲鲜品、干品多糖均不低于15%（以干基计），黄酮均不低于0.8%（以干基计），干品另外要求水分小于12%11。可见，金线莲质量（生物量、含水量及糖的含量等）的测定对金线莲进一

3、步研究有着重要意义。 图1 金线连1 实验仪器仪器名称仪器规格仪器数量电热鼓风干箱CSIOI3型，重庆1 电子天平（千分之一）YP3001N型，上海1 电子分析天平（万分之一）AE240型，常州1 低速台式离心机TDL-6013型，上海1离心管10 mL1 容量瓶25 mL3称量纸10封口保鲜袋5数显恒温水浴锅HH-4型，常州1 可见分光光度计722S型，上海1 移液器5000 L，1000 L，200 L3 烧杯500 mL，250 mL，100 mL5三角烧瓶100 mL3 量筒100 mL，10 mL1 比色皿1 cm8试管15×15010 玻璃棒1 试管架1 吸水纸1 擦镜纸

4、12 实验材料及试剂（试剂浓度等在第一栏注明）名称（浓度）数量材料新鲜金线莲植株（自备）50.0 g试剂80%乙醇（V/V，分析纯）100 mL80%浓硫酸（V/V，分析纯）100 mL蒽酮试剂（2.0 mg/mL，分析纯）100 mL标准葡萄糖溶液（200 g/mL，分析纯）100 mL蒸馏水500 mL3 实验目的 本实验旨在对金线莲的质量进行测定，通过实验掌握植物生物量与含水量的测定方法6，理解并掌握蒽酮法测定可溶性总糖含量的原理与方法7-8，为进一步研究做好铺垫。4 实验原理4.1 生物量与含水量的测定狭义的生物量是用生物的重量表示，可以是鲜重或干重。考虑到金线莲作为中药材即可鲜草出售

5、，又可干草出售，故此，既测其鲜重，又测干重。利用水遇热蒸发的原理，加热使植株内的水分蒸发，测出干重，即又可测含水量6。4.2 可溶性糖的测定可溶性糖在浓硫酸作用下，脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色衍生物，在620 nm处有最大吸收峰。在一定范围内（150 g/mL），颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于可溶性糖的定量7-8。图2 反应原理图3 糠醛衍生物溶液的吸收光谱5 实验方法及步骤5.1试剂的配制蒽酮试剂：称取0.200 g蒽酮溶于100 mL的硫酸溶液（在30 mL蒸馏水中缓慢加入76 mL比重为1.84的浓硫酸），即得2.0 mg/mL的蒽酮试剂，贮于棕

6、色瓶内，冰箱保存，最好当日配制使用；标准葡萄糖溶液：称取已在80烘箱中烘至恒重的葡萄糖100 mg，溶于蒸馏水，并稀释至500 mL，即为200 g/mL的标准液。5.2材料的处理取新鲜金线莲地上部分，弹去尘土（若表面有污物，需洗净，再用吸水纸吸去表面水分），分为三组，并分别标记为A1、A2、A3，放在称量纸上迅速称鲜重（FW）；将上述材料放入信封中，做好标记，放入烘箱，在105下杀青30 min，然后将温度调到65烘至恒重，时间在10 h左右；取出烘干的材料，称量干重（DW），以上结果记录于表1；将干样品研碎、过60目筛，妥善保存，供后续测定。5.3 金线莲生物量与含水量的测定根据表1，计算

7、含水量WC=（FW-DW）/FW×100%。5.4 金线莲可溶性总糖含量的测定5.4.1 提取与分离称取干样粉末50100 mg（平行3份）于10mL离心管中，分别标记为B1、B2、B3；加入5 mL 80%乙醇溶液，摇匀，80水浴40 min，期间不时搅拌；用少量80%乙醇溶液冲洗玻璃棒，并将溶液冷却至室温；4000 g离心10 min，上清液转入25 mL容量瓶中；再向残渣加5 mL 80%乙醇溶液，摇匀，重复在80水浴中提取两次；合并上清液于25 mL容量瓶中，并用80%乙醇溶液定容至刻度，即为待测液，冰箱保存。5.4.2 制作标准曲线取干净试管6支，按表2进行操作，并将数据记

8、录在其中。以吸光度A620 nm为纵坐标，葡萄糖溶液的糖含量C（g）为横坐标，使用Excel绘制标准曲线，见图1，计算相关系数R（R=A620 nm/C）。5.4.3 样品测定吸取待测液0.5 mL于干净试管，加入80%乙醇溶液0.5 mL；浸于冰水浴中冷却，再加入4 mL蒽酮试剂；沸水浴中加热10 min，取出后用自来水冷却至室温，在620 nm处比色，记录吸光度于表3，根据公式（1）计算结果。若测得结果不在范围内可适当稀释，约1050倍。 （1）式中：糖的质量分数（%）；C：从标准曲线上查出的糖含量（g）；V1：样品提取液的总体积（mL）；n：待测液的稀释倍数；m：样品的质量（mg）；V2

9、：测定时取样的体积（mL）；103：换算系数，1 mg=103 g。6 实验现象与结果6.1 金线莲生物量及含水量的测定结果表1 金线莲生物量及含水量的测定实验编号鲜重（FW/g）干重（DW/g）含水量（WC/%）A114.301.1891.7591.97A29.500.7991.68A314.601.1092.476.2 金线莲样品糖含量的测定结果6.2.1 蒽酮比色法定糖标准曲线表2 蒽酮比色法定糖标准曲线的制作试管编号0123456标准葡萄糖溶液/mL00.10.20.30.40.50.680%乙醇溶液/mL1.00.90.80.70.60.50.4置冰水浴中5 min，沿管壁缓慢加入蒽

10、酮试剂蒽酮试剂/mL4.04.04.04.04.04.04.0充分混匀，沸水浴中准确加热10 min，取出后用自来水冷却至室温，在620nm处比色葡萄糖溶液的糖含量/g020406080100120A620 nm00.0720.1160.1470.1730.2440.262注：葡萄糖溶液的糖含量是指试管中溶液葡萄糖的质量，用C表示，单位为g。图4 蒽酮比色法定糖标准曲线金线莲样品糖含量的测定结果表3 金线莲样品糖含量的测定样品编号m（mg）V1（mL）nV2（mL）A620 nmC（g）（%）B174.025100.5B288.025100.5B387.825100.57 分析讨论首先用测重法

11、测定金线莲样品的生物量（干鲜重比为8.03%）与含水量（91.97%），干样品粉末使用80% 乙醇提取其中的可溶性糖成分。可溶性糖是许多中草药的有效成分之一, 具有抗癌、抗炎、抗病毒、提高免疫能力等作用。而可溶性糖多无法直接测定，本文利用多糖在硫酸的作用下，水解成单糖分子，并迅速脱水生成糖醛衍生物, 然后与蒽酮生成深绿色化合物,以比色法测定其含量，结果表明，此方法简便，金线莲可溶性糖含量为 %。此方法适合中草药中多糖含量的测定。实验中，也存在一些问题，如：（1）预实验时的葡萄糖溶液标准曲线的制备，曾选用0.5mL蒸馏水代替0.5mL 80%乙醇溶液，加入蒽酮试剂出现乳白色浑浊，经过查找文献资料

12、与实验，最终确定使用80%乙醇溶液；（2）在实验过程中, 发现影响显色的重要因素是水浴放置时间, 一般置沸水浴中10 min后立即用冷水冷却至室温, 能得到较好的测定结果；（3）由于时间等条件限制，未能消除其他物质以及实验误差对测定结果的影响，在实际质量测定工作中，要消除其他物质的影响，还需增加稳定性实验、重复性实验、回收率的测定等。综上所述，该批金线莲样品的质量标准符合要求。8 注意事项8.1 控制变量试验中注意控制变量，使得每次比较都具有科学性与合理性。8.2 显色反应蒽酮试剂与糖反应的呈色程度随时间发生变化，故样品需尽快比色；且该显色反应非常灵敏，所用器皿需洁净。8.3 实验安全使用浓硫酸时，缓慢加入，注意安全，如不慎溅到皮肤，立即用自来水清洗。参 考 文 献1 全国中药草汇编编写组. 1992，全国中药草汇编M. 北京:人民卫生出版社：165.2 唐健, 邓元荣, 桌仪荣. 金线莲的药理活性研究进展J. 海峡药学, 2008, (12):52-55.3 龚宁，邓琳琼，唐秀兰等. 花叶开唇兰清除活性氧作用研究J. 中药药理和临床，2006，22(2):39-41.4 钟岑生. 金线莲的药用价值与开发J.