细菌生物膜技术

1、“生物膜技术”：关于微生物膜研究的一项多学科的综述Esther Karunakaran·Joy MukherjeeBharathi Ramalingam·Catherine A.Biggs摘要 人们对生物膜形成的研究不是一个新的现象。生物膜的普遍存在及其意义和各种形成过程鼓励人在这个领域已经长达四十年的广泛研究。在这篇评论当中，我们强调来自不同学科的技术。我们用这些技术已经成功地描述了细胞外、细胞膜以及细胞内部的成分。这些成分对了解生物膜的形成起着很重要的作用。为了减少对研究生物膜的复杂性，以前的研究者通常采用带有学科性质的具体方法单独地去研究生物膜的不同组成成分。最近有些

2、研究主张综合不同的技术对生物膜得到更加全面的认识，但是这种方法一直处于初期阶段。为了获得对生物膜形成过程全面的认识以及确切地阐述有效的生物膜控制方法，在接下来的十年里研究人员应该意识到对生物膜的研究（换就话说，生物膜技术逐渐形成一门独立学科），以及多学科综合研究在这一领域的重要性。关键词 生物膜 生物膜技术 细胞外的 细胞内的 多学科的 细胞膜引言 在自然界，细菌以本身彼此粘连形成的组织或者以细胞膜粘连而形成固着的组织而存在。这种组织对所处环境的变化能够做出反应以及能够适应环境的变化，或者像多细胞组织一样执行特殊任务(Costerton et al. 1999, OTooleet al. 20

3、00; Hall-Stoodley and Stoodley 2002)。细菌的生物膜是指细胞和细胞外界聚合物接界以及细胞彼此之间粘结成的膜结构。细胞膜是细胞在生长过程中细胞与细胞表面、细胞与细胞之间的联系的介质(Davey and OToole2000, OToole et al. 2000)。细菌聚集是一种彼此之间相互联系的微生物形成一种稳定的多细胞簇现象(Marshall1976)。因此这中聚合物也能成为生物膜，其表面物质很少被定义(Daveyand OToole 2000)。细菌能形成多细胞组织的能力使它们彼此之间相互依附在一起，或者使它们形成一层膜。而细菌的这种行为在多种学科以及生物

4、技术、环境和医药工程等方面的应用起着重大的作用，这对现代社会既有积极的作用也有消极的作用。在污水处理过程中不同聚合物的生成是微生物组织的重要应用，如活动的沉淀絮状物(Biggs and Lant 2000)、好氧型或厌氧型小颗粒(Adavet al. 2008; Skiadas et al. 2003)。微生物组织能提高分开治理水污染的效果。在酿造工艺中，酵母菌组织对整个酿造过程也有着积极的影响(Bauer et al. 2010)。生物膜在生物治理技术(Cohen 2002)和微生物燃料电池技术(Erable et al. 2010)上得到积极的应用。在这些例子中，聚合物在悬浮液中成功地的生

5、成，或者细菌附着成膜结构使生物膜技术更加具有实用意义。然而，相反的地，细菌的聚集和生物膜对工业过程和人类的健康都起着决定性的作用。例如，每年全球与处理生物污染有关的过程工程的花费多达几亿英镑(Riedewald and Sexton2006)以及大约65%的医源性感染与表面附着的微生物有关(Resch et al. 2005)。人们对生物形成的研究不是一种新的现象。人们对生物膜最早的报告应追溯到80年以前(Henrici 1933, Zobell 1943)。人们在40年以前就发现生物膜在环境中普遍存在(Costerton 2007)。因此，自从20世纪70年代开始，人们对生物膜和基于生物膜的

6、技术的兴趣稳定的增加。实际上，在对特别以生物膜为标题的文章进行搜索中，我们发现从2000年到2010年期间人们已经发表了5100篇文章，并且逐年稳定地上升（见图1）(Web of Science（wok.mimas.ac.uk) Science Citation Index Expanded,accessed 15/03/11)。 有几种方法已经被应用于研究细菌细胞与细胞之间、细胞与细胞膜之间的联系。在这篇评论中，我们强调关键技术（如显微镜学、光谱学、遗传学和蛋白质组学）的应用和从不同的学科（如表面和高分子科学、微生物学、生物化学）中找到能够描述生物膜的细胞外、细胞表面以及细胞内的组成成份。这

7、样在提高生物膜的研究方面，多学科扮演着重要的角色，提倡把“生物膜技术”本身发展成为一门学科。尽管在对生物膜的研究中存在着潜在的限制，但是这篇评论还是强调这领域将来有着重于多学科共同研究的潜力。细胞外的环境是关键：细胞外面在发生什么事？形成生物膜的细胞的当前环境中存在稠密的蛋白质，大部分研究都是把了解这些生物膜中的蛋白质之间的联系作为研究的对象。细胞外聚合物形成占生物膜容量的90%以上的基质并且是是微生物的主要来源(Flemming and Wingender 2010)。虽然EPS的各种成份，如蛋白质、糖类，DNA和膜囊已经被证实(Flemming et al.2007)，由于一组未知的大分子

8、存在于细菌细胞外，EPS被称为细胞的保护伞1992)。细胞外蛋白质的形成需要消耗大量新陈代谢的产物；因此，EPS的存在对生物膜的形成和维持是至关重要的。通过细菌附着而产生的EPS确实已经被誉为生物性的标记(Stoodley et al.2002)；在稳定的基质中生成的EPS成分之间的相互作用机制至今仍是一个丰富的研究领域。在过去的几十年里，人们承担的研究集中对这些生物聚合物的粘附和粘性特征的了解。在研究EPS的成分方面，人们使用的分析技术大体上分为两种：无损技术和从以损坏的生物膜中提取EPS成分技术。激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）技术是目前应用最普遍、无损伤技术，它是被用来显示生物膜中各种E

9、PS成分的时间分辨堆积。在应用这项技术中，通过增加荧光探针EPS中的不同成分都能被肉眼识别。例如使用贴有异硫氰酸盐标签的荧光素对蛋白质的定位，使用荧光增白剂或刀豆凝集素对糖类的定位。使用蓝色核酸荧光染料标记的核酸通过激光共聚焦扫描显微镜能被显现（for more details ofthe specific probes for eachcom- ponent, please refer to Adavet al. 2010)。激光共聚焦扫描显微镜对人们了解微观领域中生物膜的空间组织和形成过程扮演着重要的角色(Lawrence et al. 2007)。傅里叶变化红外光谱学是另外一种显示生物膜

10、中EPS成分的时间分辨堆积的无损技术。在这项技术中，各种与EPS相关的官能团的堆积以及EPS聚合物构象的转变由在总反射系数衰减的晶体上直接生长的生物膜显现出来(Delille et al. 2007; Quilèset al. 2010)。，也可以由喜欢在像不锈钢或塑料方面表面生长的生物膜显现出来(Pink et al. 2005; Bosch et al.2006; Cheung et al. 2007; Ojeda et al. 2008)。傅里叶变化红外光谱学显微镜有助于对生物膜的微观分析，包括EPS模型。尽管通过CLMS比通过傅里叶变化红外光谱学反射显微镜更能详细的观测EPS

11、的空间分布，但是FTIR一直能够提供有关EPS中官能团的有用信息，这些官能团在维持生物膜生长起到依附和黏着的作用(Geoghegan et al. 2008)。从断裂的生物膜中提取的EPS的傅里叶变化红外光学图谱已经绘制完成(Eboigbodin and Biggs 2008; Tapia et al. 2009; Liang et al.2010; Karunakaran and Biggs 2011)。将在一节进一步讨论的拉曼光谱和表面增强拉曼光谱的使用已经应用于对EPS模型的分析(Ivleva et al. 2009)。尽管无损技术在原位显现技术中被使用，更多共同采用的策略是去分析从不可

12、避免蜕变的生物膜中获得的EPS。从对蛋白质和糖类总量的比色测定以及蛋白质与多糖的数量比计算的结果得出，通常起着支配作用的蛋白质成分导致絮状物和生物膜的稳定而不是糖类(Sheng et al. 2010)。详细的生物化学分析显示多糖成分既能包括同聚多糖，例如沙门氏鼠伤寒菌内的细胞质膜(Zogaj et al. 2001)，也能包括充满的杂聚多糖，例如铜绿假单胞菌内的聚阴离子状的藻酸(Evans and Linker1973; Wozniak et al. 2003)，大肠杆菌内的结肠酸(Danese et al. 2000)，黄色葡萄球菌细胞内附着的多糖(Götz 2002)。目前的了

13、解证实含有像二价阳离子(例如Ca2+ 、 Mg2+)的无机物的细胞外多聚物与金属元素之间的作用集中在一个面上，这个面影响絮状物和生物膜的物理性质以及加强了它们的化学稳定性(Biggs et al. 2001;Geoghegan et al. 2008; Körstgens et al. 2001)。生物膜外的蛋白质扮演大量新陈代谢的角色。人们就生物膜内的蛋白质成分的重要性产生了一个观点，这个观点是EPS基质可能起着有效的外消化系统的作用(Flemming and Wingender 2010)。多糖基质内的胞外酶非流动性的生物化学意义在铜绿假单胞生物膜内的残余硅酸盐中的脂肪酶的保留的

14、案例被证实(Mayer et al. 1999)。生物膜中像肽酶、多糖酶和磷酸酯酶等酶的活性已经被证实。这些酶提高了周围环境中的营养物质的生物利用率(Romani et al. 2008; Neu and Lawrence 2009)。蛋白质成分与EPS中的多聚糖之间的相互作用也能具有结构意义，例如，枯草芽孢杆菌生物膜中塔莎的分泌蛋白和胞外多聚糖(Branda et al. 2006)。通常，人们认为糖结合肽、外援凝集素的产生对生物膜结构的完整性起着重要的作用(Neuand Lawrence 2009)。近来致力于对EPS的蛋白成分的详细的生物化学分析的工作也能对研究维持枯草芽孢杆菌生物膜稳定

15、结构的糖结合肽作出一点小贡献(Karunakaran and Biggs 2011)。基质中聚合物之间通过静电引力作用、范德华力相互作用、极性相互作用以及影响生物膜稳定的氢键作的物理作用的概念也已经被旋转粘度计表明(Mayer et al. 1999)。通过称作为聚合物架桥絮凝过程，人们也已经发现EPS分子在克服细菌与其表面之间的静电排斥中扮演着重要的角色。因此，保证了细菌与其表面坚定的、不可逆的附着(Neu and Marshall 1990;Karunakaran and Biggs 2011)。这样研究的结果已经激励人们去研究新的能减少生物黏着的新表面涂层(Yuan et al. 200

16、9; Khoo et al. 2009)。除了物理化学特性之外，人们已经详细地研究了几种微生物的EPS在基因水平上的生长过程的微控。例如，枯草芽孢杆菌中构成胞外多聚糖的基质是通过在一个单独的操纵子上编码的基因（eps 操纵子）以及一个胞外蛋白塔莎产生的(Kearns et al. 2005)。参与生产和加工塔莎的胞外聚合物操纵子和基因已经被证实是在几种转录调节剂控制下发挥作用的(Kearns et al.2005)。在适当地删除突变体过程中，生物膜形成和成熟的减少可以通过肉眼观察被证实(Kearns et al. 2005)。最近，EPS产生的转录控制也已经被证实发生在枯草芽孢杆菌中(Irno

17、v and Winkler 2010)。同样，人们一直在研究通过细胞内循环诊断一磷酸盐水平对EPS产生进行控制(Jenal and Malone2006)。一项对枯草芽孢杆菌组成的生物体的胞外蛋白的广泛研究表明多效性调节剂PlcR在调节胞外蛋白的生长过程起着重要作用(Gohar et al. 2002; Gohar et al. 2008;Oosthuizen et al. 2002)。最终，人们对生物膜期望的作用，例如对环境消毒(Flemming and Wingender2010)、不期望的作用，例如表面生物依附和对热交换器壁的隔离，直接与基质成分吸附性有关。生物膜胞外酶的稳定和集中有助生

18、物膜作为对生物异源物和组织蛋白降解的强大集团的功能(Flemmingand Wingender 2010)。另一方面，由生物膜金属蛋白结合而成的不断增加的金属离子对表面的微生物腐蚀起着很大的作用(Neu and Lawrence 2009)。EPS聚合物的依数性(Keiding et al.2001)能降解阻碍热量传递的热交换器壁并且能降低工业生产效率(Flemming and Wingender 2001)。尽管对生物膜的外部环境（例如EPS）的研究有来自像显微镜学、光谱学、生物化学、表面科学和遗传学的纳米技术（见图2）并且成功地为研究团体提供了丰富的信息，很少产生限制。没有意识到提取技术的

19、限制和生物膜中EPS成分的完整恢复存在着挑战。基质聚合物容易受到细胞新陈代谢的影响，从而能够改变稳固生物膜的物理力。因此，当用于补充对细菌细胞表面和胞外多聚物的物理作用的了解的时候，对与细胞新陈代谢的增殖相结合的胞外多聚物的研究能够对生物膜中EPS的相互作用、调节和控制有更好集中的了解。是关于表面吗？胶质物和生物膜的联合依附在培养基中的共同体是生物膜的最简单的形式。因此，对用于生物膜形成的培养基的要求吸引了不少从事多聚物和表面科学研究的人们去研究可能促进或者阻碍生物膜形成的培养基的特性。类似于胶体粒子的细菌细胞的大表面积与体积之比形成了Derjaguin, Landau, Verwey and

20、 Overbeek (DLVO) 理论，这个理论支配着胶体粒子粘附成表面并且适用于新型细菌粘附在底层(Bos etal. 1999)。DLVO理论把胶体对表面的依着力解释为长程力作用的的结果，例如静电力的作用和粒子和表面之间的里夫施茨范德华力(Poortinga et al. 2002)。细菌和胶体的类似突出了描述细菌细胞表面以及在培养基的特征的重要性。因此，大量使用来自胶体或表面科学的丰富的技术，一些研究组已经发现了与胶体的稳定和依着力有关的细菌细胞的特性。根据DLVO理论，胶体粒子的稳定性受两个因素的影响：（1）疏水性，（2）表面电荷。用胶体科学的方法去研究细菌依着和生物膜的形成，因此，在

21、这个领域，研究集中在描述细菌细胞表面的这两个特性是不罕见的。Busscher 和Weerkamp（1987）认为在细菌依着方面疏水性能从接触区脱水，能够使脱水的部分直接通过短程作用相互影响(Busscher and Weerkamp 1987)。对干细菌接触角的测量(Van Loosdrecht etal. 1987a)是一种决定细菌表面疏水性的常用的方法。这种方法比用微生物粘附的碳氢化合物的含量测量法(Rosenberg et al.1980)、疏水作用色谱法(Roettger and Ladisch 198 9)、两相分配试验和使用硫酸铵的盐聚集试验(Rozgonyi et al. 198

22、5)之类的方法更为常用。Van Loosdrecht et al. (1987a)报道细胞表面疏水性和细胞对疏水基粘附性之间线性正相关。Van der Meiet al. (1998)也曾用过接触角测量法去研究许多不同种类的细菌的细胞表面脱水性，并且断定表面疏水性对每个菌株是唯一的和依赖于菌株的生长期和生长率。这个结论表明控制细菌细胞之间的粘附的潜在相互作用力不是常量并且能够改变对生物活性的依赖。Allison et al. (1990a, b)也曾发现细胞表面疏水性和生物膜之间的联系，即疏水性的下降导致铜绿假单胞生物膜菌和大肠杆菌生物膜的释放。Van Loosdrecht et al. (1

23、987b)认识到当细菌的表面电荷也能被包括在粘附模型中，对细菌粘附力的精确预测诗可以做到的。细菌细胞表面的电荷通常由测量电脉迁移率和推断电位所决定(Wilson et al. 2001; Hong andBrown 2008)，它们是水溶液和接到细菌细胞上流体静电层之间界面的电势(Klodzinska et al. 2010)。人们已经发现像细胞表面疏水性一样，细胞表面的电荷因不同生长阶段(Eboigbodin et al.2005; Walker et al. 2005)、细胞代谢(Hong andBrown 2010)以及基因的差异(Eboigbodin et al.2006)的生物活性不

24、同而不同。细胞表面的电荷的变化决定了细胞聚集的能力(Marshall 1976;Rijnaarts et al. 1995; Eboigbodin et al. 2007)。采用譬如接触角和电泳迁移迁移的技术能测定细菌群体的平均胶体性质。然而细菌细胞表面的独特生物成分导致这些胶体性质的原因，这些独特生物成分的反过来能控制导致粘附性的相互作用类型(Marshall 1976; Rijnaarts etal. 1995; Torimura et al. 1999; Eboigbodin et al. 2006; Hongand Brown 2008; Ojeda et al. 2008)。因此，人

25、们在生物膜研究领域已经取得了使用分析化学技术方面的进展。例如，使用红外和拉曼光谱学技术(Mukherjee et al. 2011)以及最先进的X射线光电子光谱学技术(Yala et al. 2010)描述相互黏着的生物细胞的表面化学性质。红外光谱学技术在微生物领域应用了40多年(Heber et al. 1952;Norris 1959)。FTIR(傅里叶变换红外光谱学)被广泛应用微生物生态学研究和生物膜研究(如 Bosch et al. 2006; Ojeda et al. 2008;Mukherjee et al. 2011)。如前面提到的，使用FTIR为了生物膜的研究去描述化学官能团的

26、有点是生物膜可以被无损地、直接地、在线地和实时地观察。由于生物膜代表着一个极其复杂的系统，许多不同的信号产生于胞外聚合物、细胞膜和细胞质的分子振动，它们可以对整体的RTIR光谱也有影响。RTIR光谱能够显示生物大分子的特征函数以及生物膜样品和它们的浮游生物配对物的比较。这些浮游生物配对物往往会显示与多糖和蛋白质相关的相关的官能团的变化(Schmitt and Flemming 1998; Bosch et al.2006; Ojeda et al. 2008; Mukherjee et al. 2011)。使用FTIR的主要缺点是样品在分析之前是干燥的。拉曼光谱学技术也能为样品的的化学成分提供

27、信息，但是必须在水和环境中。因此，它比FTIR有优势并且从而被广泛地用于生物分析(study of tissues, biofluidsand bacterial cells) (Beier and Berger 2009; Wagneret al. 2009; Carmona et al. 1997; Choo-Smith et al. 2001)。拉曼光谱学技术和表面增强拉曼光谱技术的应用已经能够分析水合生物膜样品，包括EPS的成分(Hudson and Chumanov 2009, Ivleva et al. 2009)以及嵌入在EPS内的微观组织(Andrews et al. 2010

28、; Schwartz et al. 2009)。CLMS与拉曼光谱学的联合使用已经能够对不同种类的自由生长的生物膜的形成进行原位比较(例如，野生型铜绿假单胞菌和它的突变体(Sandt et al. 2009)以及能够区分不同种类的生长在生物膜上细菌（例如，血链球菌和突变链球菌之间(Beier et al. 2010)）CLMS与拉曼光谱学在水合环境下联合使用对描述多种物种生物膜的表面有了很好的保证。关于细菌细胞表面的分子成分的化学信息能通过在原子级上使用X射线光电子光谱学技术(XPS)获取(Rouxhet et al. 1994; van der Mei et al. 2000)。各种原子（例

29、如，碳原子、氧原子、氮原子和磷原子）的组成百分比以及它们在细胞表面的键合环境都通使用XPS分析出来。一些研究已经集中在将细胞表面成分的原子比例与细菌和酵母菌的细胞表面的物理化学性能联系在一起(Hamadiet al. 2008; Ahimou et al. 2007; van der Mei et al. 2000;Amory et al. 1988)。某些研究已经使用XPS来分析环境样(Pastuszka et al. 2005)本或者分析在改变培养条件的情况下细胞表面的改变(Dufrêne and Rouxhet 1996; Herben etal. 1990)。上面提及到的研究

30、目前仅仅在浮游细菌上完成，但是对建立理化特性的技术与XPS之间的相关性极为有用，这里用的用的细胞是在分析之需要冻干。几乎非常少的研究试图将XPS分析与附着成面的浮游细胞的细胞表面物理化学性质联系在一起(Cerca et al. 2005; Dufrene et al. 1996; Denyer et al. 1990;Mozes et al. 1989)。在这些研究中，XPS分析已经可能对细胞表面分子进行识别，包括对初始粘附的表面进行识别。Cerca et al.(2005)意识到初始粘附与随后生物膜的生长一直不存在相关联系并且断定细胞表面附着的高分子介质可能与介导细胞细胞的相互作用不同。同时

31、XPS在识别细胞表面高分子成分的变化方面存在着潜力，将来的研究应该集中在将表面附着细胞和浮游细胞进行比较从而了解生物膜形成过程中的生理变化与细胞表面变化的相关性。联合分析化学和用于描述细菌描述表面特性的胶体方法的应用已经鼓励多学科的研究活动（见图3）。然而影响细胞表面的特殊生物分子的细胞内的活动（例如基因表达调节）与导致附着的化学功能团的观察到的变化之间的联系需要将来去调查研究。就表面蛋白（见下一节）而言，这是值得更多关注的，但是通过特定的化学分析将细胞表面的特殊指纹与导致高分子（它是形成指纹的原因）产生的生物机制连接在一起目前没有看到。图3此外，最近Mukherjee et al. (201

32、1)、Karunakaran 和 Biggs (2011)已经表明附着细胞与自由浮动细胞的细胞表面特性存在差别。因此，当推断或预测由生物膜的形成和维持引起的相互作用时，细菌的胶体特性应该进一步把这些变化考虑进去。细胞内的活动怎样呢？毕竟它也是生物学过程在微生物学家的带领下，人们对识别基因和蛋白质生物学的基础环境的适应策略如生物膜形成的广泛研究在近几十年里已经完成。现在被人们广泛接受的是有生物膜的细胞生理学与自由浮动浮游增长方式的细胞生理学是截然不同的。基因组测序技术和如通过芯片对基因组进行分析技术的利用性能使得生物膜研究领域超越更多传统的基于显微镜的微生物学并且能够对细胞代谢进行详细的分析。D

33、NA芯片技术已经被用于识别大肠杆菌生物膜的一些现在比较适用的整个基因表达研究的整个基因表达谱(see areview by Wood 2009)。有关铜绿假单胞菌生物膜DNA芯片的研究已经表明少量的基因被差异性表达(Stoodley et al. 2002;Whiteley et al. 2001)。对附着、自动聚集以及一些新的基因簇的基因编码倾向于对对生物膜细胞的高度表达或者诱导后过渡到生物膜生长(Schembri et al. 2003)。与基因芯片检测技术平行，转录分析技术已经被用于研究生物膜的形成。这项技术被用于研究生物膜生成过程中的生理机能、表型、运动、代谢活性和细胞间的信息传递。这

34、项技术中使用的纯培养菌有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、十细菌、绿脓杆菌和霍乱弧菌(Beenken et al. 2004; Beloinet al. 2004; Ren et al. 2004; De Souza et al. 2004; Whiteleyet al. 2001; Moorthy and Watnick 2005)。然而，没有出现具体的生物膜的形成全球模式。虽然如此，在全球基因表达谱中识别的特殊基因角色的确认有可能用于有针对性的遗传变异研究。因此，基因操作对了解和识别与生物膜形成和附着有关的特性至关重要(Stoodley et al. 2002; Hall-Stoodley et a

35、l. 2004; Beloin andGhigo 2005)。例如，OToole et al(2000)用CRC突变铜绿假单胞菌研究生物膜的发展。csrA基因（这是一个用于碳源代谢多效调控蛋白）的中断增加了生物膜的形成。同时，这篇评论的目的不是详细描述所有的导致增强或减弱生物膜形成的基因突变，接下来的几段将进一步给出一些例子。Prigent-Combaret et al. (2000)通过对影响大肠杆菌生物膜的curli转录的积极和消极调节发现了两个自动调节系统，OmpR/EnvZ（EnvZ DNA结合反应调节器）和CpxR/CpxA（CpxA DNA结合反应调节器）(Stoodley et

36、al. 2002)。Barrios et al. (2006)研究发现大肠杆菌中的Hha(渗透胁迫调节器)和YbaJ(假设蛋白)由于缺失的原因，通过减少生物膜的质量来调节生物膜。Hha 和 YbaJ的缺失恢复了细胞的流动性并且减少了细胞的集成。Domka et al. (2006)完成的研究表明大肠杆菌中的yceP(假设蛋白)和yliH （通过吲哚运输调节对生物膜形成的抑制）有助于生物膜的形成。Sheludko et al. (2008)研究了固氮螺菌生物膜上脂多糖(LPS)和卡尔科弗卢尔结合多糖(CBPS)合成中突变的影响。固氮螺菌Sp245生物膜的厚度和抗原性以及在LPS和CBPS合成缺失

37、的突变表明在酸性LpsI合成中缺失的突变在亲水性表面生成比较厚的生物膜，并且这种在细菌的亲水性表面生成的、不能合成CBPS生物膜是不太明显的。这项研究断定LPS结构中一个根本性的改变是与亲水性和疏水性表面上的相关突变体的生物膜形成活动相关的。它也能提供了表面高分子（如LPS）和附着物之间的联系并且是与上一节提到的胶体研究的联合起来去研究生物活性与表面性质的联系的选择物。细菌密度感知信号系统中特定的基因突变已经导致生物膜形成的改变。当描述空肠弯曲菌生物膜时，Reeser etal. (2007)发现最大生物膜的形成所需要空肠弯曲菌弯曲突变的群体感应在它们形成生物膜能力方面与野生菌相比明显在减少。

38、Huang et al. (2009)的研究也已经报道突变链球菌生物膜形成包括细菌依赖弯曲密度感知信号系统。通过扫描电子显微镜、光显微镜和荧光显微镜观察发现在链球菌突变中，变形基因的淘汰被表明损害生物膜生长(Sztajer et al. 2008)。转运蛋白YdgG的缺失减少了细胞外以及提高了细胞内群体感应分子自动诱导物2 (AI2).的浓度。由于YdgG加强了AI-2的转运，YdgG的缺失导致生物膜厚度和流动的细胞的数量减少(Herzberg et al. 2006)。通常，细菌彼此之间是通过使用化学信号分子或自动诱导剂进行交流（AI）。原核微生物例如革兰氏阴性菌产生酰基高丝氨酸内酯（AHL

39、）作为信号分子以及革兰氏阳性细菌产生寡肽作为信号分子(Miller and Bassler 2001)。细菌能对由同种细菌以及其它种类的细菌产生的大量的AI作出反应，AI为内部和外部物种交流提供了基础。有LuxS蛋白产生的自动诱导剂-2信号（AI-2）介导革兰氏阴性菌与物革兰氏阳性菌种间的交流。作为遗传反应，群体感应细菌的信息交流通过AHL和AI-2系统与生物膜的生成产生联系(Costerton et al. 1999; Bassler 2002; Simoes et al. 2007)。除了AI-2控制生物膜的生成之外，AHL介导基因的表达表明物种（如铜绿假单胞菌(De Kievit et

40、al. 2001)、鼻疽菌(Brackman et al.2009)）之间控制生物膜的生成以及在自然环境样本（如埋石灰岩和水回收系统）中控制生物膜的生成(McLeanet al. 1997; Hu et al. 2003)。遗传分析为人们提供了关于细菌适应环境改变的潜力、生物膜的形成以及能显示哪些基因已经在过程中转录的mRNA的测定（通过DNA微阵列）信息。另一方面，蛋白质成分的分析为人们提供了关于样本在精确的时候发生的新陈代谢活动的信息。蛋白质组学能够同时在蛋白质水平上对全部基因的表达进行分析，并且为研究生物系统提供了关键的策略(Hatzimanikatisand Lee 1999)。因此，

41、蛋白质对于研究观察发生在生物形成过程中的生理变化提供了有力的工具。 使用半定量二维凝胶电泳的蛋白质组学研究已经比较生物膜和自由浮游生物的胞外蛋白质图谱并且表明不同在包括代谢、运输和调节过程中蛋白质存在明显的区别(Otto et al.2001; Sauer and Camper 2001; Steyn et al. 2001;Oosthuizen et al. 2002; Trémoulet et al. 2002; Vilain etal. 2004a, b; Welin et al. 2003; Resch et al. 2005; van Alenet al. 2010)。在蛋

42、白质分析中进步也已经产生了基于非凝胶的定量技术的问世，例如相对和绝对定量的同位素标记技术（iTRAQ）。Mukherjee et al. (2011) and Pham etal. (2010)都用iTRAQ技术去确定大肠杆菌的生物膜和浮游细胞和牙周病原菌Tannerella forsythia之间的蛋白质数量。对定量蛋白质组学的进一步分析有可能使用各种统计技术将蛋白质表达与生物膜形成中潜在的代谢途径联系在一起(Mukherjee et al. 2011)。除了细胞质可溶性蛋白质，通过外膜蛋白质的双向凝胶电脉对蛋白质的研究已经完成，例如1型伞端大肠杆菌在粘附形成生物表面期间外膜蛋白的成分发生了

43、明显的变化(Resch et al.2005; Otto et al. 2001)。Pham et al. (2010)使用定量的非凝胶为基础的蛋白质组技术也发现生物膜细胞中的外膜蛋白质的表达增强了。全球基因组和蛋白质组学研究对于浮游和生物膜表型的基因或蛋白质表达以及生物膜形成过程中基因突变菌株的调查极为有用（见图4），然而，在这一领域的研究存在着价值，这些研究通常受到测序微生物的限制，尤其是铜绿假单胞菌和大肠杆菌，并且在生物膜形成过程中还没有一个独特的基因组能对表型变化负责。因此使得发展完全基于基因表达的策略比较困难。图4观察细菌从游离态到形成生物膜过程中发生的变化的研究已经完成。然而，人们

44、因该更加努力的去发现细胞内生物变化的影响以及细菌表面的物理化学特性的影响，这最终对生物膜的形成产生影响。生物膜各方面的全面的蛋白质组分析能够为生物学过程（胞内蛋白质），特殊的表面功能团（表面和/或膜蛋白）和周围胞外多聚合物（EPS中的蛋白质）的联系提供洞察力，但是，直到现在蛋白质的研究重点仍然聚集在浮游细胞上，而不是直接在生物膜细胞上或者仅仅部分生物图片上。结语生物技术在工业上的巨大潜力、生物膜在传染病以及其它疾病上普遍存在和研究生物膜的复杂性已经在研究团队中激发了广大的兴趣。为了减少研究生物膜的复杂性，目前的研究已经采取了基于部分的研究并且在这样做的过程中人们已经获得大量的关于生物膜形成的各

45、方面的知识，例如胞外聚合物的作用，环境条件的影响、基板性能和在生物膜形成过程中的分子控制。来自各种学科的技术创造性的应用验证了生物膜的形成现象，并且带来了多学科共同研究巨大的潜力。尽管在基于部分研究生物膜形成的方法中，多学科的联合已经激励人们去研究潜在的生物膜控制策略，专门设计适合应用需要的生物膜的目的是不会成功的。为了成功控制生物膜的形成，研究人员需要意识到生物膜的研究，例如，生物技术，已经演变成了一门独立的学科（见图5）以及各种学科和研究的视野相互合作是至关重要的。谢鸣 这些作者希望对英国工程与物理科学研究委员会（EPSRC）为Karunakaran提供比格斯高级研究金(EP/E05355

46、6/01)以及进一步的计划援助(EP/E053556/01和 EP/E036252/1)比并且设菲尔德大学为Karunakaran 和 Ramalingam提供奖学金表示感谢。这些作者声明他们没有利益冲突。参考文献Adav SS, Lee DJ, Show KY, Tay JH (2008) Aerobic granular sludge:recent advances. Biotechnol Adv 26:411423Adav SS, Lin JCT, Yang Z, Whiteley CG, Lee DJ, Peng XF, ZhangZP (2010) Stereological ass

47、essment of extracellular polymericsubstances, exo-enzymes, and specific bacterial strains inbioaggregates using fluorescence experiments. Biotechnol Adv28:255280Ahimou F, Boonaert CJP, Adriaensen Y, Jacques P, Thonart P, PaquotM, Rouxhet PG (2007) XPS analysis of chemical functions at thesurface of

48、Bacillus subtilis. J Colloid Interface Sci 309:4955Allison DG, Brown MR, Evans DE, Gilbert P (1990a) Surfacehydrophobicity and dispersal of Pseudomonas aeruginosa frombiofilms. FEMS Microbio Lett 71:101104Allison DG, Evans DJ, Brown MR, Gilbert P (1990b) Possibleinvolvement of the division cycle in

49、dispersal of Escherichia colifrom biofilms. J Bact 172:1667Amory DE, Mozes N, Hermesse MP, Leonard AJ, Rouxhet PG (1988)Chemical analysis of the surface of microorganisms by X-rayphotoelectron spectroscopy. FEMS Microbio Lett 49:107110Andrews JS, Rolfe SA, Huang WE, Scholes JD, Banwart SA (2010)Biof

50、ilm formation in environmental bacteria is influenced bydifferent macromolecules depending on genus and species.Environ Microbiol 12:24962507Barrios AFG, Zuo R, Ren D, Wood TK (2006) Hha, YbaJ, and OmpAregulate Escherichia coli K12 biofilm formation and conjugationplasmids abolish motility. Biotechn

51、ol Bioeng 93:188200Bassler BL (2002) Small talk: cell-to-cell communication in bacteria.Cell 109:421Bauer FF, Govender P, Bester MC (2010) Yeast flocculation and itsbiotechnological relevance. Appl Micro Biotechnol 88:3139Beenken KE, Dunman PM, McAleese F, MacApagal D, Murphy E,Projan SJ, Blevins JS

52、, Smeltzer MS (2004) Global geneexpression in Staphylococcus aureus biofilms. J Bact186:46654684Beier BD, Berger AJ (2009) Method for automated backgroundsubtraction from Raman spectra containing known contaminants.Analyst 134:11981202Beier BD, Quivey RG, Berger AJ (2010) Identification of different

53、bacterial species in biofilms using confocal Raman microscopy. JBiomed Opt 15:066001Bellon-Fontaine MN, Rault J, Van Oss CJ (1996) Microbial adhesionto solvents: a novel method to determine the electron-donor/electron-acceptor or Lewis acidbase properties of microbialcells. Colloids Surf B Biointerf

54、aces 7:4753Beloin C, Ghigo JM (2005) Finding gene-expression patterns inbacterial biofilms. Trends Microbiol 13:1619Beloin C, Valle J, Latour-Lambert P, Faure P, Kzreminski M,Balestrino D, Haagensen Ja J, Molin S, Prensier G, Arbeille B,Ghigo JM (2004) Global impact of mature biofilm lifestyle onEsc

55、herichia coli K-12 gene expression. Mol Microbiol 51:659674Biggs CA, Lant PA (2000) Activated sludge flocculation: on-linedetermination of floc size and the effect of shear. Water Res34:25422550Biggs CA, Ford AM, Lant PA (2001) Activated sludge flocculation:direct determination of the effect of calc

56、ium ions. Water SciTechnol 43:75Bos R, Van Der Mei HC, Busscher HJ (1999) Physico-chemistry ofinitial microbial adhesive interactionsits mechanisms andmethods for study. FEMS Microbiol Rev 23:179230Bosch A, Serra D, Prieto C, Schmitt J, Naumann D, Yantorno O(2006) Characterization of Bordetella pert

57、ussis growing asbiofilm by chemical analysis and FT-IR spectroscopy. ApplMicro Biotechnol 71:736747Brackman G, Hillaert U, Van Calenbergh S, Neils HJ, Coenye T(2009) Use of quorum sensing inhibitors to interfere with biofilmformation and development in Burkholderia multivorans andBurkholderia cenoce

58、pacia. Res Microbiol 160:144151Branda SS, Chu F, Kearns DB, Losick R, Kolter R (2006) A majorprotein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. MolMicrobiol 59:12291238Busscher HJ, Weerkamp AH (1987) Specific and non-specificinteractions in bacterial adhesion to solid substrata. FEMSMicrobio Lett 46:165173Carmona P, Bellanato J, Escolar E (1997) Infrared and Ramanspectroscopy of urinary calculi: a review. Biospectroscopy3:331346Cerca N, Pier GB, Vilanova M, Oliveira R, Azeredo J (2005)Quantitative analysis of adhesion and biofilm formation onhydrop