组织细胞原位凋亡实验

1、 TUNEL 法测凋亡操作步骤一、TUNEL检测原理 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是采用非同位素方法来检测细胞在凋亡过程中DNA 的断裂情况，可在原位快速准确地检测单个凋亡细胞。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。 其原理是细胞凋亡发生时，内源性核酸酶激活，使DNA的双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）作用下，组织细胞原位DNA切口可被标记上生物素-dUTP，即TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End L

2、abeling），可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，显示为棕色（过氧化物酶活性），特异准确地定位正在凋亡的细胞，在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3'-OH 形成，很少能够被染色。二、试剂盒组份 组 份 10 assays 25 assays 储存条件A：Equilibration Buffer 1.0 mL 2.5 mL -20 B：Biotinylated Nucleotide Mix 10 L 25 L -20 C：TdT

3、Enzyme 10 L 25 L -20 D：500×Proteinase K 10 L 25 L -20 20×SSC 15 mL 38 mL 4 E：Streptavidin-HRP 10 L 25 L 4 F：20×DAB Substrate Buffer 50 L 125 L 4 G：20×DAB Chromogen 50 L 125 L 4 H：20×Hydrogen Peroxide 50 L 125 L 4 三、操作流程1.操作流程概览2.细胞样本制备准备： PBS：8.0g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44g Na2H

4、PO4，0.24g KH2PO4，溶于800ml去离子水中，HCl调pH至7.4，加水定容至1L。 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制； 封闭液：3%H2O2溶于甲醇； 细胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鲜配制；操作步骤：1)经过实验处理的细胞爬片或细胞涂片，自然晾干；2)室温固定15min30min；PBS漂洗3×5min；3)浸入封闭液中，室温封闭10min；PBS漂洗3×5min；4)浸入细胞膜通透液中，室温30sec2min；5)进行标记反应。3.石蜡包埋组织切片预处理准备： 石蜡切片脱蜡至水：二甲苯脱蜡2×10

5、min，梯度乙醇水合（100%、95%、90%、80%、70%）； 蛋白酶K工作液：2 L500×蛋白酶K + 998 L PBS； 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制； 封闭液：3%H2O2溶于甲醇。操作步骤：1)石蜡包埋的组织切片按常规方法脱蜡至水；2)PBS漂洗3×5min；3)加入蛋白酶K工作液，37反应1530min；PBS漂洗3×5min；4)（选择进行）室温固定15min30min；PBS漂洗3×5min；5)浸入封闭液中，室温封闭10min，PBS漂洗3×5min；6)进行标记反应。4.冰冻组织切片预处理准备

6、： 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制； 封闭液：3%H2O2溶于甲醇； 细胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鲜配制；操作步骤：1)冰冻切片浸入固定液，室温固定10min；PBS漂洗3×5min；2)浸入封闭液中，室温封闭10min；PBS漂洗3×5min；3)浸入通透液中，室温30sec2min；4)进行标记反应。5.阳性对照和阴性对照的准备TUNEL检测时需要设立阳性对照和阴性对照，以显示实验的客观性和准确性。1)阳性对照样本的处理（选择进行） DNaseI反应液（用户自备）： （10U-3000U DNase I；40mM T

7、ris-HCl pH 7.9； 10 mM NaCl；6mM MgCl2；10mM CaCl2）组织样本经过蛋白酶K处理或者通透液处理，PBS浸洗后，加入100 L DNaseI反应液，室温孵育1030min，用去离子水彻底清洗玻片，浸入PBS漂洗5min，进行标记反应。2)阴性对照样本的处理 在进行标记反应过程配制TdT酶反应液时，不加入TdT酶，其余步骤相同。四、标记和显色反应以下操作在湿盒内进行。1.预处理好的样本经过PBS漂洗后，用滤纸轻轻吸去样本周围液体；2.每个样本滴加100 L TdT酶反应液，于37#61616;C避光反应60min；TdT酶反应液的准备（即用即配）： 成分 标

8、准100 L/片 切片数 总体积 Equilibration Buffer 98 L × = Biotinylated Nucleotide Mix 1 L × = TdT Enzyme 1 L × =阴性对照片不加TdT酶。3.用去离子水按1：10稀释20×SSC，进行终止反应，室温15min；然后PBS漂洗3×5min；4.浸入0.3%H2O2/PBS中封闭内源性过氧化物酶活性，室温孵育35min；PBS漂洗3×5min；5.滴加100 L Streptavidin-HRP工作液（按1：500稀释为工作液），于37反应3060min；6.PBS漂洗3×5min；7.滴加DAB显色液： 成分 100 L/片 切片数 总体积 20×DAB Substrate Buffer 5 × = 20×DAB Chromogen 5 × = 20×Hydrogen Peroxide 5 × = ddH2O 85 × =8.用去离子水漂洗数