3D多细胞肿瘤球的培养

1、3D多细胞肿瘤球的培养3D多细胞肿瘤球是在体外应用组织培养方法使肿瘤细胞以多细胞集聚 体的形式生长成为具有三维结构的球体。与传统的2D贴壁细胞培养模型相比，3D多细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网 络、细胞与基质、 细胞与细胞之间的相互作用， 从而更加贴近肿瘤组织中相应的 病理生理特征。因此，3D多细胞肿瘤球培养模型已经逐渐应用于干细胞培养和分化、 癌症研究、 药物和毒性筛选及组织工程等特定应用中。虽然3D多细胞肿瘤球模型具有更显著的实体肿瘤生理相关性，但是与2D贴壁细胞培养模型相比，获得大量相对统一的 3D多细胞肿瘤球模型需要一系列的培养 过程和表征手段。本文利用Liquid OVerlay的

2、制备方法，以乳腺癌细胞MDA-MB-23和MCF-7为模 型制备3D多细胞肿瘤球并采用倒置显微镜、激光共聚焦显微镜和环境扫描电镜 对其进行详细表征。1实验前准备工作1. 提前24 h取12 mLDME和 RPM11640完全培养基（含10%FBS下同）于50 mL 离心管内，置于4C冰箱中预冷；2将分装好的Matrigel基质胶提前24 h从-20C放入4C,使其融化成液体状 态；3.将无菌的1 mL移液器枪头放入无菌50 mL离心管内，置-20C冰箱预冷琼脂糖包被 96 孔板1.准确量取6 mL RPMl 1640培养基（或DME培养基）于2个10 mL的注射玻 璃瓶内，加入90 mg琼脂糖

3、，盖塞后放入80C的水浴锅内加热溶解30 min ;2.加热结束后，将注射瓶放入灭菌锅内，115°C灭菌30 min ;3. 灭菌完成后，迅速取出注射瓶放入超净台内。将注射瓶内的琼脂糖溶液倒入 无菌的加样槽中，用多通道移液器以每孔 60 L的量加入96孔板内。注意：由于琼脂糖溶液在室温时会凝固， 因此从灭菌锅内取出琼脂糖溶液后一定要快速转移至超净台内并迅速加入至 96 孔板中。此外，为保证加样时琼脂糖不冷却，需要同时灭菌加样槽和100 L的移液器枪头。4. 加入完成后， 96 孔板要保持水平约 30 min 使孔内的琼脂糖凝固3配置含 Matrigel 基质胶细胞悬液1.取对数生长期

4、的MDA-MB-23细胞（或MCF-7细胞），胰蛋白酶消化后进行细 胞计数，用 RPMl 1640完全培 养基 （或DME完全培 养基） 将细胞悬液浓度调整 至 2.0×105 cells/mL ，备用。2. 将盛满碎冰的烧杯喷完酒精后放入超净台内，将 RPMI 1640 完全培养基以及 解冻的 Matrigel 基质胶从冰箱内取出置于冰上。注意：由于 Matrigel 基质胶在室温下溶液凝固，因此在操作过程中一定要保持 低温。3. 将预冷的移液器枪头取出放置于超净台内。根据计算量（ 2.5%，v/v ）用移液 器将 300 L Matrigel 基质胶加入到 12 mL RPMI

5、1640 完全培养基内，迅速混 匀。注意：由于 Matrigel 基质胶在室温下溶液凝固，因此使用的移液器枪头也需要 预冷。4.加入步骤1中的细胞悬液（约600 L）,使细胞浓度为10000 cells/mL , 迅速混匀，备用；4将细胞悬液铺入琼脂糖包被的 96孔板1. 将上述步骤 4 中配置好的含有 Matrigel 基质胶的细胞悬液放入加样槽内, 用 多通道移液器吸取200 L加入到包被琼脂糖的96孔板内。2.采用低温离心机进行离心，离心条件为 4C, 1000× g, 10 min注意：离心 96 孔板时为保持无菌,将 96 孔板的周围用封口膜封住。3.离心完成后，取出96孔

6、板，摘下封口膜，喷洒酒精后放入培养箱内培养。整 个培养流程如图1所示。4. 在培养的第3、5和7天，更换孔内的100 L培养基并采用倒置显微镜观察 肿瘤球的形态。025. 若要采用3D多细胞肿瘤球进行药物试验，在培养 7天后，用移液器取出孔内 的100 L培养基，加入100 L给药溶液，然后置于培养箱内培养并定期米用 倒置显微镜观察肿瘤球的生长状况（图 2）。3D多细胞肿瘤球的表征51.倒置显微镜观察3D多细胞肿瘤球形态：直接将96孔板置于倒置显微镜下观 察即可。2. 激光共聚焦显微镜观察：用移液器小心取出孔内的肿瘤球，用 PBS青洗3遍 后，采用4%多聚甲醛固定，并用HOeChSt 33258对细胞核