m6去甲基化酶alkbh5通过影响foxm1表达和自我维持胶质瘤干细胞的致瘤性

1、The m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicityof Glioblastoma Stem-Like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Programm6A去甲基化酶ALKBH5通过影响FOXM1表达和自我更新维持胶质瘤干细胞的致瘤性Cancer CellIF：27.407April 10, 2017：Wendy汇目 录CONTENTSPART 03结果PART 04借鉴总结PART 01背景介绍PART 02思路PART 05衍生定题1.背景介绍背景介绍G

2、lioblastoma（胶质瘤）实体脑部肿瘤存活率低，易复发胶质瘤干细胞：自我更新抗化疗放疗调控机制未知胶质瘤干细胞如何调节自我更新和致瘤性？背景介绍修饰m6A在胶质瘤中如何？ALKBH5cALKBH5 ：哺乳动物RNA 去甲基化酶N6甲基腺苷：体内常见mRNA修饰物c胶质瘤中DNA 甲基化很常见且研究多RNA m6A的甲基化机制未知ALKBH5与肿瘤的研究较少ALHBH5是如何调控在胶质瘤中发挥去甲基化作用的？胶质瘤中调控RNA甲基化？背景介绍Transcription factor FOXM1FOXM1：参与细胞，G1/S 和 G2/M 转换,S期抑制FOXM1：胶质瘤中过表达，预后差调节

3、胶质瘤干细胞增殖调节胶质瘤干细胞自我更新调节胶质瘤干细胞致瘤性FOXM1在胶质瘤癌干细胞中与m6A的功能未知FOXM1受谁调控？ 如何调控？2.思路思路胶质瘤干细胞中ALKBH5表达情况ALKBH5R如何调节底物的功能ALKBH5R和底物的结合方式ALKBH5对胶质瘤干细胞的增殖和自我更新以及致瘤性有何影响？ALKBH5R底物的功能是？（即在胶质瘤中的作用）ALKBH5的调节底物是ALKBH5R和底物间的相互作用受什么影响思路检测ALKBH5在GSC中的表达情况生信 RNA-seq analysis免疫荧光 WBEDU增殖体释稀ALKBH5对胶质瘤干细胞的影响自我更新小鼠预后分析和成瘤实验致瘤

4、性PIA分析 RNA seqALKBH5的底物筛选ALKBH5对底物FOMX1的影响qPCR WB 免疫荧光报告RNA seqALKBH5如何调控FOMX1RIPPull down调节方式RIP WBF-AS调节功能F-AS调节方式ALKBH5如何影响FOMX1和HuR的关系FOMX1相互作用蛋白筛选RIPF-AS如何调节ALKBH5和FOXM1的相互作用FOMX1上游调节因子寻找生信EDU增殖稀体释自我更新小鼠预后分析和成瘤实验致瘤性结合位点3.结果 3. 分析胶质瘤干细胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在胶质瘤细胞中调节 FOXM1的表达 5. ALKBH5如何调控FOXM1？

5、 结果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 谁调节 ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促进GSC 自我更新2.2 ALKBH5促进胶质瘤干细胞的增殖2.3 ALKBH5促进胶质瘤干细胞的致瘤性1.ALKBH5 在 胶质瘤中高表达，在胶质瘤中是一个负向预后因子1.ALKBH5 在 胶质瘤中高表达，在胶质瘤是一个负向预后因子中结果RNA seqA.生信ALKBH5高表达的GSC，存活率低；B.不同细胞ALKBH5表达量分析C.免疫组化检测ALKBH5和SOX2表达分析；D，相关性分析E.RNA seq 分析不同GCM和GSC中ALKBH5表达量分析 3. 分析胶质瘤干细胞

6、中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在胶质瘤细胞中调节 FOXM1的表达 5. ALKBH5如何调控FOXM1？ 结果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 谁调节 ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促进GSC 自我更新2.2 ALKBH5促进胶质瘤干细胞的增殖2.3 ALKBH5促进胶质瘤干细胞的致瘤性1.ALKBH5 在 胶质瘤中高表达，在胶质瘤中是一个负向预后因子 结果2.1 ALKBH5促进GSC 自我更新三种GSC细胞系F.体外有限稀释实验证明干扰ALKBH5，抑制GSC自我更新结果2.2 ALKBH5促进胶质瘤干细胞的增殖胶质瘤细胞胶质瘤干细胞A.

7、ALKBH5对胶质瘤细胞的存活率无影响；B. 干扰ALKBH5引起GSC G0期阻滞A.细胞存活率检测；B.BrdU检测细胞增殖；结果2.3 ALKBH5促进胶质瘤干细胞的致瘤性C.干扰ALKBH5抑制GSC自我更新；拯救实验恢复自我更新能力；突变酶活位点不能拯救自我更新能力。D.干扰ALKBH5促进GSC小鼠的存活率； E.干扰ALKBH5抑制小鼠GSC体积小结表达高表达不表达增殖自我更新致瘤性ALKBH5胶质瘤干细胞胶质瘤正常 3. 分析胶质瘤干细胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在胶质瘤细胞中调节 FOXM1的表达 5. ALKBH5如何调控FOXM1？ 结果7. F-AS和

8、FOXM1 的功能6. 谁调节 ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促进GSC 自我更新2.2 ALKBH5促进胶质瘤干细胞的增殖2.3 ALKBH5促进胶质瘤干细胞的致瘤性1.ALKBH5 在 胶质瘤中高表达，在胶质瘤中是一个负向预后因子结果3. 分析胶质瘤干细胞中 ALKBH5的底物 RNA seq深度 分析，找到m6A序列m6A 相关胶质瘤干细胞相关ALKBH5相关 找到单一峰选择不同GSC干细胞系两种shRNA进行干扰结果3. 分析胶质瘤干细胞中 ALKBH5的底物分析干扰ALKBH5BCm6A分析IPA分析A.干扰GSC中ALKBH5的表达后，分析差异性（两个细

9、胞系，2个shRNA取交集）；B.干扰ALKBH5后，GSC中腺苷酸甲基化N6位甲基化水平（即m6A）上升C.RNA seq深度发现干扰ALKBH5后，GGACU这个序列中A的甲基化上升D.干扰ALKBH5后，唯一的峰有5053个结果3. 分析胶质瘤干细胞中 ALKBH5的底物筛选得到12个，与ALKBH5以及m6A相关，以及单一峰值的只有12个结果3. 分析胶质瘤干细胞中 ALKBH5的底物85个FFOXM1的靶包含在内且符合趋势进一步分析85个，发现F中表明FOXM1的均为FOXM1的靶可能性很大结果3. 分析胶质瘤干细胞中 ALKBH5的底物小结 ALKBH5 胶质瘤干细胞m6A底物16

10、个下游FOMX1 3. 分析胶质瘤干细胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在胶质瘤细胞中调节 FOXM1的表达 5. ALKBH5如何调控FOXM1？ 结果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 谁调节 ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促进GSC 自我更新2.2 ALKBH5促进胶质瘤干细胞的增殖2.3 ALKBH5促进胶质瘤干细胞的致瘤性1.ALKBH5 在 胶质瘤中高表达，在胶质瘤中是一个负向预后因子结果4.1 ALKBH5 促进 FOXM1的表达A,B.干扰ALKBH5抑制FOMX1mRNA和蛋白表达；D,E，F.免疫荧光分析ALKBH5和FOXM1的

11、共及相关性分析结果4.2 FOXM1 前体转录本是 ALKBH5的底物RNA的转录没影响RNA的转运没影响RNA的稳定性没影响 3. 分析胶质瘤干细胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在胶质瘤细胞中调节 FOXM1的表达 5. ALKBH5如何调控FOXM1？ 结果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 谁调节 ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促进GSC 自我更新2.2 ALKBH5促进胶质瘤干细胞的增殖2.3 ALKBH5促进胶质瘤干细胞的致瘤性1.ALKBH5 在 胶质瘤中高表达，在胶质瘤中是一个负向预后因子结果5.1 FOMX1 转录本分析Foxm1转

12、录本分析FOXM1转录本分析以及引物设计结果5.1 FOXM1 前体转录本是 ALKBH5的底物RNA聚合酶抑制剂HuR:核内RNA结合蛋白F.干扰ALKBH5抑制FOXM1前体转录本的表达；分析；G.ALKBH5G.免疫组化进行ALKBH5分析结果5.2.ALKBH5结合FOXM1的 3UTR端B.Foxm1的3UTR在干扰ALKBH5 N6腺苷酸会被去甲基化A.甲基化峰检测，Foxm1 3UTR上有单一峰结果5.3. 证实ALKBH5调节FOXM1的 3UTR端mRNA水平蛋D.包括3UTR序列的FOXM1才会在干扰ALKBH5后被降解包含有3UTR的序列有作用E.报告实验进一步验干扰AL

13、KBH5后会抑制含有3UTR片段的FOXM1的表达结果5.4. ALKBH5促进HuR 和FOXM1 转录起始转录本相互作用mRNAD. 干扰ALKBH后减少了HUR和FOMX1之间的结合E，F. FOXM1和HuR间的关系：干扰HuR 抑制FOXM1的转录蛋白小结转录和蛋 ALKBH5 FOXM1底物调控3UTRHuRPre-FOMX1 mRNA相互作用 3. 分析胶质瘤干细胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在胶质瘤细胞中调节 FOXM1的表达 5. ALKBH5如何调控FOXM1？ 结果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 谁调节 ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1

14、 ALKBH5促进GSC 自我更新2.2 ALKBH5促进胶质瘤干细胞的增殖2.3 ALKBH5促进胶质瘤干细胞的致瘤性1.ALKBH5 在 胶质瘤中高表达，在胶质瘤中是一个负向预后因子结果6.1.FOXM1-AS 是FOXM1起始转录本的核 lncRNAA.F-AS结构分析于核C.F-ASB.在胶质瘤及干细胞中的表达分析结果6.2. 证实FOXM1-AS 是FOXM1起始转录本的核 lncRNA相关性分析mRNA水平蛋A,B.干扰F-AS后，抑制FOXM1表达； C.F-AS和FOXM1表达呈正相关F-as和FOMX1前体作用AMT:不影响蛋白间相互作用的一个RNA-RNA固定物注：探针无f

15、omx1结合区域；用探针拉F-asF.F-AS和FOXM1前体转录本结合D.F-AS和ALKBH5相互作用： 用ALKBH5拉到了F-ASE.F-AS探针检测到ALKBH5证明F-AS可以和ALKBH5直接结合正向反向拉结果6.3. FOXM1-AS 有利于ALKBH5 和 FOXM1起始转录本的相互作用结果6.4. FOXM1-AS 是一个核 lncRNA 有利于ALKBH5 和 FOXM1起始转录本的相互作用反向实验，6.3是干扰ALKBH5,此处是干扰F-AS 后反证，进一步表明三者的结合作用K.值得注意的是：干扰F-AS后， HUR富集量也减少了小结LNCRNA转录结合能力F-AS促进

16、ALKBH5和FOMX1的结合发挥促进FOMX1 mRNA的转录的作用Pre-FOMX1 mRNAALKBH5F-ASPre-FOMX1 mRNA 3. 分析胶质瘤干细胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在胶质瘤细胞中调节 FOXM1的表达 5. ALKBH5如何调控FOXM1？ 结果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 谁调节 ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促进GSC 自我更新2.2 ALKBH5促进胶质瘤干细胞的增殖2.3 ALKBH5促进胶质瘤干细胞的致瘤性1.ALKBH5 在 胶质瘤中高表达，在胶质瘤中是一个负向预后因子结果7. 1 FOXM1-

17、AS 促进GSC的增殖自我更新和成瘤性D, E.抑制F-AS抑制GSC的增殖；F.抑制F-AS抑制GSC的自我更新结果7. 2 FOXM1-AS 促进GSC的干性G.神经分化的标志检测；干扰A,B:多能性检测；过表达结果7.3. FOXM1 拯救 由 ALKBH5 或FOXM1-AS敲除引起的GSCs增殖抑制A. FOXM1拯救ALKBH5干扰引起的FOXM1的下游抑制量化分析B.FOXM1拯救ALKBH5或F-AS干扰引起的GSC肿瘤生长抑制结果7.4. FOXM1 恢复 由 ALKBH5 或FOXM1-AS敲除引起的GSCs增殖抑制移植瘤增殖干性拯救干扰F-AS引起的增殖和干性抑制拯救干扰

18、ALKBH5引起的增殖和干性抑制小结FOXM1可以拯救干扰ALKBH5或F-AS引起的生物学效应：拯救移植瘤中干性表达拯救胶质瘤形成拯救FOXM1靶表达机制图4.总结借鉴9.总结可借鉴的方法及内容正常细胞癌细胞癌干细胞借鉴点1做对比实验案例改进9.总结可借鉴的方法及内容借鉴点2筛选处证据十分充足，不仅寻找功能相关差异显著的，还考虑到的下游9.1 总结可借鉴的方法及内容1.颅内肿瘤实验：小鼠随机分组。存活率实验：小鼠颅内注射10,000 GSCs 直到垂死 或注射后 80 天。 拯救实验： GSCs 利用 ALKBH5 或 FOXM1-AS shRNA共转染 FOXM1,ALKBH5 质粒。 50,000 GSCs 颅内注射进入小鼠 (n = 8). 注射后30天 （GSC11） ，20 天（GSC17小鼠安乐死并 收获大脑。