高中生物选修基因工程基本操作程序 (2)

1、高中生物选修基因工程基本操作程序 (2)补：原核细胞的基因结构补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子 RNA RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。并与其结合。 转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，并分子移动，并以以DNADNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNARNA。 转录完毕后，转录完毕后，RNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着RNARN

2、A聚聚合酶也从合酶也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。启动子启动子一个典型的真核细胞基因结构示意图一个典型的真核细胞基因结构示意图l编码区含有编码区含有外显子外显子内含子

3、内含子l真核生物的结构基因是断裂基因真核生物的结构基因是断裂基因非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子1 12 23 34 45 5真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码序列：非编码序列： 包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子非编码区非编码

4、区非编码区非编码区编码区编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子1 12 23 34 45 5加加 工工转转 录录mRNAmRNA前体前体成熟成熟mRNAmRNA加加 工工原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_ _ 的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细

5、胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些? ?（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人

6、工合成）人工合成请阅读请阅读P9P9第一和二两段第一和二两段 将含有某种生物不同基因将含有某种生物不同基因的许多的许多DNA片断，导入到受体菌片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因这种生物的不同基因，称为基因文库文库基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cDNA文库）文库）1.1.基因文库基因文库基因组基因组文库与文库与部分基部分基因文库因文库的关系的关系2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法鸟枪法：鸟枪法：供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限

7、制酶与载体连接与载体连接载入载入受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入目的基因目的基因分离分离( (直接分离法直接分离法) )( (一一) )从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因反转录法：反转录法： 以目的基因转录成以目的基因转录成的信使的信使RNARNA为模板，反为模板，反转录成互补的单链转录成互补的单链DNADNA，然后在酶的作用下合成然后在酶的作用下合成双链双链DNADNA，从而获得所，从而获得所需的基因。需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA杂交双链杂交双链( (单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA反转录酶反转录酶核酸酶核酸

8、酶H H2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA( (目的基因目的基因) )求异思维求异思维 你能推测出由你能推测出由mRNA反转录形成反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？的过程大致分为哪些步骤吗？反转录酶既可以利用反转录酶既可以利用DNA又可以利用又可以利用RNA作为模板合成与之互补的作为模板合成与之互补的DNA链。像其他链。像其他DNA聚合酶一样，反转录酶也以聚合酶一样，反转录酶也以53方向合成方向合成DNAcDNA合成过程是：第一步，反转录酶以合成过程是：第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNA互补的互补的DN

9、A单链，形成单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶杂交分子。第二步，核酸酶H使使RNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的链降解，使之变成单链的DNA。第三。第三步，以单链步，以单链DNA为模板，在为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链链，形成双链DNA分子。分子。根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ： 根据已知蛋白质根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测的氨基酸序列，推测出相应的信使出相应的信使RNARNA序序列，然后按照碱基互列，然后按照碱基互补配对原则，推测出补配对原则，推测

10、出它的结构基因的核苷它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法根据已知氨基根据已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，工作量大，盲目，分离出来的

11、有时并分离出来的有时并非一个基因非一个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要很不稳定，要求的技术条件较高求的技术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸仅限于合成核苷酸对较少的简单基因对较少的简单基因思考思考: :为什么要构建基因文库为什么要构建基因文库? ?直接从含有目的基因的生物直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗体内提取不行吗? ?( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ (_ (做

12、启动子做启动子) )、 _._.前提条件：前提条件：原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：选修选修1 P1 P6060聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因b、PCR（聚合酶链式反应）技术扩增（聚合酶

13、链式反应）技术扩增由穆里斯等人于由穆里斯等人于1988年发明，并于年发明，并于1993年获得若贝尔化学奖。年获得若贝尔化学奖。PCR反应的过程：（变性、退火、延伸、多次重复）反应的过程：（变性、退火、延伸、多次重复）变性变性退火退火延伸延伸结果：双链结果：双链DNA分子数为分子数为2n可获取大量目的基因可获取大量目的基因过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9490-94）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（、退火（复性复性25-6525-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局

14、部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链寻根问底寻根问底将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？结果会怎样？ 有人采用总有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载取出来，通过注射或花粉管通道法

15、导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物导入了受体植物,不好检测与筛选不好检测与筛选,同时也无法增强目的基因的表达同时也无法增强目的基因的表达水平水平,也不能确定目的基因产物的存在部位。也不能确定目的基因产物的存在部位。构建基因表达载体的目的构建基因表达载体的目的a、使目的基因在受体细胞中稳定遗传的、使目的基因在受体细胞中稳定遗传的b、使目的基因复制并遗传给下一代、使目的基因复制并遗传给下一代c、同时使目的基因能表达和发挥作用。、同时使目的基因能表达和发挥作用。1.1.用一定的

16、用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个

17、切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 核心核心同一种同一种( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建4.4.过程过程: :5.5.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因它们有什么作用？它们有什么作用？( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农

18、杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达阅读掌握（阅读掌握（P12-13）根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？上说，你应该如何做？原因

19、：研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香原因：研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，

20、一般为乙酰丁香酮以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNA上。上。( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检

21、测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）抗原抗体杂交抗原抗体杂交 细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。步培养、研究。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物v多细胞生物的检测，将每个受

22、体细胞单独培多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。保留有相应变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉铃例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到明摄

23、入了抗虫基因并得到表达。表达。（从个体水平鉴定）（从个体水平鉴定）1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C2）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来

24、连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶3）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料资料思考与探究思考与探究1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？为什么？不可以。因为目的