AB液质操作规程

1、第一部分 开关机A A 、开机1.打开UPS电源，打开氮气发生器（气瓶），确认Curtain gas的输入压力为0.4MPa，gas1/2为0.7MPa，exhuast为 0.4MPa。2.打开机械泵电源开关（5500系列直接打开质谱主机电源，仪器自动启动机械泵）3.等机械泵工作至少30min5.打开质谱主机电源开关6.过夜抽真空B B 、关机1.停止输液：关停针泵或液相泵，或断开输液管线（一般质谱主机Standby后液相系统也自动待机，输液泵自动关停，但建议操作人员再次确认，必须保证没有任何液体再泵入质谱）2.使仪器待机，并灭活配置2.关闭质谱仪主机电源开关（5500系列只需按下电源开关旁的

2、VENT按键排放真空）3.机械泵继续工作至少30min4.关闭机械泵上的电源开关（5500系列会自动关停机械泵，待机械泵停止后即可关闭5500系列主机上的电源开关）5.关闭气体发生器或气瓶第二部分 调谐1、PPG就是正离子校正液，PPG3000负离子调谐液，本台仪器只用两瓶校正液，正离子一瓶，负离子一瓶。洗液一瓶50%的甲醇水。调谐前先用洗液洗针两次。吸校正液的时候慢慢吸，避免吸入气泡，吸好以后将针泵卡住。再将高度调到5，将管路重新连接。不再连接六通阀，由质谱直接进样，且将针泵的速度调到10L/ml。2、调谐液弄好后在仪器面板工具栏上：TOOl项目创建项目。此项目为一个文件夹，文件夹里面包括所

3、有此次采集的信息，方法、序列等，且所有采集的项目都固定在一个文件夹下面：D:/Analyst Data/Project。新建项目的时候，弹出窗口中有个Add All，可以创建孙文件夹。3、联机：软件打开后在左上方硬件配置（单机选中，双击打开）只需选中仪器MSactive profile。图标变为绿色，表示联机成功。调谐只需要选中质谱。仪器的实时状态可以点击右下方的图标，质谱和液相都是单独观察，质谱要注意真空度，为0.5.4、调谐手动调谐项目（文件夹）选中下拉菜单中的Installation 20161102（为系统默认的调谐文件夹），先Q1start syring pump（打开针泵）star

4、t（质谱），开始采集以后观察基线是否平衡，若等两分钟还未平衡好，则手动将针泵往上抬。5、平衡好后（基线平稳则为平衡好），重新进样，重新点击start syring pump。Resolution（分辨率）advanced（高级选项）（看到结果后调节质量轴和分辨率做准备，只能先打开这个，再打开谱图）实时质谱图右键open file随便点一个框软件上方的从谱图校正 PPG.POS(正离子) start出现三行：（1、质量轴。2、分辨率。3、两次调谐的差异）若质量轴有差异右上角 yes若分辨率飞离出虚线offset（偏大调大，偏小调小）输入校正的数值，再重新进样，如此反复，直到点落在虚线以内，实线代

5、表最合适。6、校正好后仪器会自动保存，直接关掉窗口即可。负离子调谐和正离子调谐步骤一样，只是在选择方法的时候要注意选择负离子模式。还有看结果时要选择PPG3000.此为负离子调谐液。调谐因针泵流速很小，10L/ml，所以不需要设定离子源温度及辅助气，直接设定喷雾器流速为50，就可以将样品雾化，气帘气也不需要设置，因为没有多余的溶剂需要吹走。第三部分：方法优化1.在Analyst软件Tools菜单中选择ProjectCreate Project。在Project name项下输入新建的Project名称。注意，不要点选窗口中的其他按钮！点击OK，确认新建Project。2.在Analyst软件界

6、面下，双击导航栏内Hardware Configuration。在弹出窗口中选择MassOnly，点击Activate Profile，激活MassOnly（只联接质谱主机）。3.在导航栏内单击Tune and Calibrate，进入调谐模式。点击上方工具条中的T钮。此时，应注意到主机有“扑”声音，表明进入调谐状态。此时右下角质谱状态显示绿色。双击Manual Tuning，进入质谱参数设置及运行窗口。4.使用1mL玻璃进样针吸取适当标准溶液，置于进样针座上。点击MS Method下拉菜单，选择Syringe Pump Method，设定针泵流速Flow Rate为10L/min。 5.点击

7、Start Syringe Pump按钮开针泵进样。6.返回MS Method，选择扫描模式Scan Type为Q1 MS，设定扫描速度Scan Rate为10Da/s，设定扫描范围StartStop设定为50化合物分子量。DP预输入60。7.点击start开始采集数据。运行稳定后，注意观察是否有预期的母离子出现，并控制其响应值在约E4以下。点击stop，选择第一个峰（后面是同位素峰）的平稳段，双击，选中母离子。点击右键，选择Delete Pane。8.设定Scan type为产物离子扫描Product Ion（Ms2），扫描速度200Da/s，选择扫描正/负离子，输入母离子（product

8、of），设定扫描范围startstop为50MW+20，覆盖可能的子离子质量范围，点击compoud标签，设定（DP）60，（CE）5。9.点击start，开始采集数据，注意观察是否有预期的母离子出现。手动调节CE，以5eV为步长，逐渐增加。每次增加后稍作等待，直至目标化合物的子离子清晰看见。选择平稳的一段，双击，选择子离子。10.选择Scan Type为MRM。设定参数表格中的Q1对应的母离子，Q3对应的子离子，time（ms）为50，ID值设为 名称 1（定量），名称 2（定性）。11.点击Edit Ramp，在Parameter下选择Collision Energy，点击OK。点击sta

9、rt开始采集数据，记录每个MRM通道的最佳CE电压。在MRM参数设定表中，右键点击。选择Collision Energy CE，调出表格中的CE列，输入每个MRM通道的最佳CE电压值，精确到个位数。重复以上步骤，在Parameter项下选择Declustering Potential，优化并保存DP。完成后选择菜单File/Save保存采样方法，文件名.dam。 第四部分：方法建立一、LCMS方法的建立：1、连接仪器：打开 HPLC质谱电源，将 HPLC系统接上柱子，将6号出口管线与离子源连好。调离子源喷雾针位置到2mm处，双击Hardware Configure，在硬件配置菜单下单击LCMS

10、 ( 液相与质谱联用 )， 单击Activate profile激活仪器，会听到笛的一声，说明仪器已经连接上。 2、确认液质同步：选择项目（之前优化方法的时候已经建立的项目）；双击 Build acquisition method新建方法，弹出新建方法模板。在模板左侧点击acquisition method，模板右边显示对应的参数，确认synchronization mode选择LC Sync,表示液质同步。3、设置MRM参数：点击方法模板左侧的MRM, 在模板右侧 Scan Type下选择 MRM；在polarity下选择化合物极性：Positive(正离子)、Negative（负离子）；D

11、uration为15min(与液相分离相同的时间)；表格中Q1：母离子分子量，Q3(Da)：子离子分子量，Time（msec）：50，ID栏：化合物名称（离子对名称后空格加1为定量，空格加2为定性），在表格中右键分别单击DP、CE，点击工具栏的OPEN打开之前优化的方法参数，调出DP,CE值，选中整行， Ctrl+c(复制)参数，关闭窗口，再Ctrl+v(粘贴)参数）；最后点击Edit parameter设置离子源参数：Source/Gas项用以下推荐值：CUR 35，IS:5500(正离子) 或-4500（负离子），TEM 600，GS1 60，GS2 70，点击OK。4、设置液相参数：点击

12、模板左边的shimadzu LC system，在右边的pumps栏下，设置stop time （运行时间）为15min， flow流速为1mL/min，A为水相设为95%，B为有机相设为5%（设置时改B，A自动），泵最大压力为50；点击time program设置液相梯度：例咪唑类梯度设置：Time(min)AB-95%5%55%95%105%95%10.195%5%1595%5%接着在右边的Auto sampler栏下，设置清洗时间，在Rinse mode 下选择Before and after(前后都洗)，并设置清洗时间为5s，清洗液用50%甲醇水。最后点击保存按钮,在保存窗口输入该方法

13、的名称。二、建立批处理：1、双击Build acquisition batch，在右边窗口set栏为批处理保存的文件夹命名以便识别，再点击add set，最后点击add sample，再选择之前建立的LC-MS方法，在弹出的窗口内的number（进样样品数）处填入需要进样的样品个数，点击OK。2、在加入的样品列表内依次填写sample name（样品名称）、via position（样品瓶的位置）、inj.volunme（进样体积：一般5微升或10微升）。3、在submit项下点击submit按钮以提交样品序列。4、点击工具条上左上角的view queue按钮 ，可查看已提交的样品。此时将仪器

14、从校正状态退出，进入分析模式。确认泵已打开，首次进样液相先排气，再平衡仪器：先点击工具条上的equilibrate平衡按钮，在弹出的平衡窗口中输入平衡时间10min，点击ok。右下角图标会变黄，待平衡结束后此处图标会变成绿色，此时即可点击start sample按钮采集样品信息，仪器会自动对已提交的全部样品进行采集。 第五部分 数据处理1. 双击打开Multiquilt，选择项目，点击File下的荧光棒型图标，点击sample，选择需要的标准品和样品数据，点击next，create new method，为方法命名，点击next，选择一个有代表性的样品（一般选择浓度较大的标品数据），设置分组（

15、同一物质定量离子和定性离子设置为一组），并指定内标，next，对每个物质进行积分。2. 设置积分参数：a、 Causian Smoth（平滑）：一般是0，如有毛刺可改成1或2；b、 Expeceted Time（保留时间）:一般不动c、 Expected time范围：一般30s，表示在保留时间±15s范围d、 最小峰宽e、 最小峰高f、 背景噪音扣除：可调整目标峰基线以下被积分的面积，比例越高积分越往下，必要时调整。g、 分峰因子 ：峰有分叉时设置，如有两个分叉，设置为2，峰分叉不能大于2h、 单位：设置单位，勾选Apply units to all可将此单位用于所有化合物点击ne

16、xt，点击finish。在新跳出窗口内将标准品选定，输入浓度。查看各化合物积分是否正常，点击第三个图标查看标准曲线。报告打印：点击File，create report，Report template（选择报告模板，一般用sample1 和标线，内标报告只能用sample1,2,3），命名，选择存储报告位置，点ok。信噪比：选择项目，双击open date file，点击sample，选择低浓度样品，点击ok，点击XIC，选择定量离子，点击ok，选中峰，按住shift，选峰附近的一段时间，点Script，点击S-ToNScript，即可得到结果。第六部分：LC-MS离子阱原理及其应用原理：在进行

17、多级质谱分析(MS-MS)时，首先限定目标质量的离子。通过调整交变电压，将大于以及小于目标质量的离子射出，从而使得仅有一个质量的离子存在于离子阱中并将其富集。目标质量的范围被称为Isolation Width。之后通过向离子阱内注入气体（通常为氦气或氮气），与离子发生碰撞使其被打成碎片。操作方法：首先在Analyst中打开一个成熟的MRM采样方法，然后右键单击Acquisition Method中的MRM，在弹出菜单中选择Add IDA Criteria Level。在新增的IDA-First Level Criteria页面中设置相关逻辑选项（其中四项尤为重要）1) Select “X”to

18、 “Y” most intense peaks，表示在多个组分色谱共流出时，指定触发最强的若干个母离子，“1 to 2”表示最强和次强的两个母离子，“1 to 3”表示最强和次强和第三位三个母离子，以此类推。请注意，如果选择了“1 to 2”或“1 to 3”，则后续的EPI个数应调整为对应的两个或三个。（一般选择两个以下）2) After Dynamic Background Subtraction of Survey Scan，表示执行动态背景扣除，使得感兴趣的母离子都尽可能的获得触发EPI 的机会。该选项尤为重要，为必选项。3) Exclude former target ions。在某些情况下，一次