氨咖黄敏胶囊微生物限度检查方法验证方案

1、氨咖黄敏胶囊微生物限度检查方法适用性验证方案目 录1. 概述2. 验证目的和范围3. 组织及职责4. 验证进度计划表5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认7.验证项目和验证方法7.1试验菌株7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证-常规倾注平皿法7.4控制菌检查方法验证常规倾注平皿法8.偏差与漏项控制9.验证报告会审1. 概述我公司生产品种氨咖黄敏胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照中国药典2015版四部附录1105

2、：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。2. 验证目的和范围验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的氨咖黄敏胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。3.组织及职责3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量部经理批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微

3、生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量部经理批准报告。3.2验证方案实施过程中的变更和偏差验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量部经理应当组织进行评估并采取相应的控制措施。3.3 验证工作小组成员表姓名部门及职务职 责 质量部经理负责验证方案及报告的批准 质量部QC组长负责验证方案审核、实施、汇总报告及培训工作 质量部QC负责验证方案起草、具体实施、报告工作4. 验证进度计划表 本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是 年 月至 年 月。5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认5.1.主要检验仪器设备确认表序号仪器设备名称型 号编号校准单位校准日期有效期至1电热恒温培

4、养箱12电热恒温培养箱23霉菌培养箱4高压蒸汽灭菌锅5单人净化工作台检查人/日期： 复核人/日期：5.2.验证所需文件的确认表文件名称是否有效版本文件保存处中国药典2015年版四部是 否质量部检查人/日期： 复核人/日期：6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认6.1.试验菌种检查表序号菌种名称代码冻干菌种批号来源1金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003中国食品药品检定研究院2铜绿假单胞菌CMCC（B）10104中国食品药品检定研究院3枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501中国食品药品检定研究院4白色念珠菌CMCC（F）98001中国食品药品检定研究院5黑曲霉CMCC（F）98003中国食

5、品药品检定研究院6大肠埃希菌CMCC（B）44102中国食品药品检定研究院7乙型副伤寒沙门菌CMCC（B）50094中国食品药品检定研究院检查人/日期： 复核人/日期：6.2试验所需的培养基检查序号名称生产厂家是否通过培养基适用性试验批号01胰酪大豆胨液体培养基北京奥博星生物公司是 否02胰酪大豆胨琼脂培养基北京奥博星生物公司是 否03沙氏葡萄糖琼脂培养基北京奥博星生物公司是 否04麦康凯液体培养基北京奥博星生物公司是 否05麦康凯琼脂培养基北京奥博星生物公司是 否06RV沙门菌增菌液体培养基北京奥博星生物公司是 否07木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基北京奥博星生物公司是 否08三糖铁琼脂培养基

6、北京奥博星生物公司是 否检查人/日期： 复核人/日期：6.3. 检验样品确认表序号品名生产厂家批号规格是否按GMP要求生产1氨咖黄敏胶囊*有限公司复方是 否2氨咖黄敏胶囊*有限公司复方是 否3氨咖黄敏胶囊*有限公司复方是 否检查人/日期： 复核人/日期：7.验证项目和验证方法7.1试验菌株氨咖黄敏胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌检查方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌。试验菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。7.2 需氧菌总数检查、

7、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，3035培养1824小时，取此培养液1ml加0.9无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-7,制成50100cfu/ml的菌悬液备用。接种白色念珠菌的新鲜培养物至100ml沙氏葡萄糖液体培养基中，2025培养23天，取此培养液1ml加0.9无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-7，制成50100cfu/ml的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，2025培养57天，直到获得丰富的孢子。加入3

8、5ml含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-7，制成50100cfu/m的孢子悬液备用。菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在28，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28 ,在验证过的贮存期内使用。验证时，对各试验菌的回收率逐一进行验证。7.3. 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证-常规倾注平皿法.供试液的制备 取供试品10.0g，加PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，制成1：10的供试液。.试验组

9、取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置3035培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。另取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置2025培养箱中培养5天，点计菌落数。.供试品对照组取1：10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45的胰酪大豆胨琼脂培养基

10、20ml混匀，平行制备2个平皿。置3035培养箱中培养5天，点计菌落数。另取1：10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。置2025培养箱中培养5天，点计菌落数。.菌液对照组取PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液1ml和7.2项下制备的50100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置3035培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。另取PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液1ml和7.2项下制备的50

11、100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置2025培养箱中培养5天，点计菌落数。. 常规倾注平皿法方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值(即试验菌的回收率)应在0 .52 范围内。. 常规倾注平皿法方法验证的结果.1. 常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果试验次数1： 氨咖黄敏胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天试验菌株菌种代数

12、试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：试验次数2： 氨咖黄敏胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：试验次数3： 氨咖黄敏胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱型号 编号 ；培养温度： ；

13、培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：.2. 常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果试验次数1： 氨咖黄敏胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5天试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：试验次数2： 氨咖黄敏胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基

14、配制批号： 培养箱型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5天试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：试验次数3： 氨咖黄敏胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5天试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：. 常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法验证小结7.4.控制菌检查方法验证常规倾注平皿法7.4.1试验菌株氨咖黄敏胶囊质量标准中规定检查的控制菌为大肠埃

15、希菌、乙型副伤寒沙门菌，所以选择这两种菌株进行控制菌检查的方法学验证。试验菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。7.4.2 控制菌检查方法验证的菌液制备分别接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，3035培养1824小时，取此培养液1ml加0.9无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-7,制成50100cfu/ml的菌悬液备用。菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在28，可在24小时内使用。验证时，对各试验菌的回收率逐一进行验证。7.4.3大肠埃希菌检查方法验证7.

16、4.3.1供试液的制备 取供试品10.0g，加PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，制成1：10的供试液。7.4.3.2.试验组取供试液10ml，加入7.4.2项下制备的50100cfu的大肠埃希菌接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，3035培养1824小时。取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,4244培养2448小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，3035培养1872小时。麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。7.4.3.3阳性对照组照7.4.2项下菌液制备方法，以0.9%无菌氯化钠为稀释液，将大肠埃希菌液稀释至含菌

17、50100cfu/ml，取 菌液1 ml，接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，3035培养1824小时。取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,4244培养2448小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，3035培养1872小时。麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。7.4.3.4阴性对照组 取PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液10ml，接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，3035培养1824小时。阴性对照应无菌生长。7.4.3.5常规倾注平皿法测定大肠埃希菌方法验证结果试验次数1：氨咖黄敏胶囊批号: 大肠埃希菌对照菌来源 批号（菌

18、种编号） 过程增菌培养选择培养分离培养结果判断培养基胰酪大豆胨液体培养基配制批号 麦康凯液体培养基配制批号 麦康凯琼脂培养基平板 配制批号 培养箱型号 编号 温度 型号 编号 温度 型号 编号 温度 培养时间开始 月 日 时结束 月 日 时开始 月 日 时结束 月 日 时开始 月 日 时结束 月 日 时试验组阳性对照组阴性对照组试验人/日期： 复核人/日期：试验次数2：氨咖黄敏胶囊批号: 大肠埃希菌对照菌来源 批号（菌种编号） 过程增菌培养选择培养分离培养结果判断培养基胰酪大豆胨液体培养基配制批号 麦康凯液体培养基配制批号 麦康凯琼脂培养基平板 配制批号 培养箱型号 编号 温度 型号 编号 温

19、度 型号 编号 温度 培养时间开始 月 日 时结束 月 日 时开始 月 日 时结束 月 日 时开始 月 日 时结束 月 日 时试验组阳性对照组阴性对照组试验人/日期： 复核人/日期：试验次数3：氨咖黄敏胶囊批号: 大肠埃希菌对照菌来源 批号（菌种编号） 过程增菌培养选择培养分离培养结果判断培养基胰酪大豆胨液体培养基配制批号 麦康凯液体培养基配制批号 麦康凯琼脂培养基平板 配制批号 培养箱型号 编号 温度 型号 编号 温度 型号 编号 温度 培养时间开始 月 日 时结束 月 日 时开始 月 日 时结束 月 日 时开始 月 日 时结束 月 日 时试验组阳性对照组阴性对照组试验人/日期： 复核人/日

20、期：7.4.3.6大肠埃希菌检查方法验证结果小结7.4.4沙门菌检查方法验证7.4.4.1.试验组取10g供试品接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中，加入7.4.2项下制备的50100cfu的乙型副伤寒沙门菌2ml， 3035培养1824小时。取上述增菌培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基,3035培养1824小时。取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，3035培养1848小时。沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典

21、型菌落，于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养1824小时。7.4.4.3阳性对照组取项下制备的50100cfu的乙型副伤寒沙门菌2ml接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中， 3035培养1824小时。取上述增菌培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基,3035培养1824小时。取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，3035培养1848小时。沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落，于三糖铁琼脂培养

22、基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养1824小时。7.4.4.4阴性对照组 取0.9%无菌氯化钠溶液2 ml，接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，3035培养1824小时。阴性对照应无菌生长。7.4.4.5常规倾注平皿法测定乙型副伤寒沙门菌方法验证结果试验次数1：氨咖黄敏胶囊批号: 乙型副伤寒沙门菌对照菌来源 批号（菌种编号） 过程增菌培养选择培养分离培养结果判断培养基胰酪大豆胨液体培养基 配制批号 RV沙门增菌液体培养基配制批号 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 平板配制批号 三糖铁琼脂培养基斜面和高层穿刺接种配制批号 培养箱型号 编号 温度 型号 编号 温度 型号 编号 温度 型号 编号 温度 培养时间 月 日 时至 月 日 时 月 日 时至 月 日 时 月 日 时至 月 日 时 月 日 时至 月 日 时试验组阳性对照组阴性对照组试验人/日期： 复核人/日期：试验次数2：氨咖黄敏胶囊批号: 乙型副伤寒沙门菌对照菌来源 批号（菌种编号） 过程增菌培养