竹节参皂苷抗风湿作用的有效性与安全性评价

1、 姓名：张 锐 学号：1522210550015 发现和甄别 临床前研究临床研究 申报及后续工作基础和应用研究发现并筛选药物来源药学药理学毒理学期临床试验期临床试验期临床试验填写新药申请后续登记活动 新药研发项目IV期临床试验临床前研究前言有效性安全性 总结新药临床前研究的内容新药临床前研究的内容药学药学 定型鉴别、定量测定、理化性质、合成路线和制剂工定型鉴别、定量测定、理化性质、合成路线和制剂工艺、稳定性及质量标准草案制订等。艺、稳定性及质量标准草案制订等。药理学药理学 药效学、一般药理学、药代动力学及可能的作用机制药效学、一般药理学、药代动力学及可能的作用机制研究。研究。 毒理学毒理学 急

2、性毒性、长期毒性、特殊毒性及其它毒性（刺激性、急性毒性、长期毒性、特殊毒性及其它毒性（刺激性、溶血、过敏、药物依赖性、）研究溶血、过敏、药物依赖性、）研究 。一、类风湿性关节炎简介 前言前言有效性安全性 总结前言 类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种自身免疫性疾病，确切病因及发病机制尚不清楚。关节的疼痛与炎症是风湿病中较为常见的临床表现，因此镇痛与抗炎是风湿病治疗学中最主要的内容。常用药物：常规药物治疗(如非甾体抗炎药、慢作用抗风湿药、糖皮质激素)、生物制剂治疗等二、竹节参简介 前言前言有效性安全性 总结前言 竹节参竹节参在土家族苗族聚居区民间医疗中被誉为“ 草药

3、之王” , 属珍稀濒危的名贵“ 七类” 中草药。竹节参为五加科植物竹节参Panax japonicus C. A. Mey. 的干燥根茎。作用：散瘀止血、消肿止痛、祛痰止咳、补虚强壮的功效，用于治疗痨嗽咯血、跌扑损伤、咳嗽痰多、病后虚弱等症。二、竹节参简介 前言前言有效性安全性 总结前言 竹节参的主要化学成分皂苷，其结构主要是齐墩果烷型五环三葩皂苷和达玛烷型四环三萜皂昔。各类型三萜类皂苷的母核结构诱导式转基因式自发式 其他诱导式TNF- 转基因型IL-1Ra-/-模型K/BxN 转基因模型HTLV-1 小鼠模型MRL/Mpj-lpr/lpr(MRL/lpr)小鼠 降植烷诱导型 胶原抗体诱导型

4、前炎症因子诱导型 卵蛋白诱导型 角叉菜胶诱导型 avridine 诱导型 蛋白多糖诱导型软骨低聚体基质蛋白诱导型啮齿类动物模型佐剂诱导型（ AA ）胶原诱导型（ CIA）链球菌细胞壁诱导型（SCW）一、竹节参总皂苷抗炎活性实验研究前言有效性总结安全性实验动物：SPF级昆明种小鼠,体重202g,雌雄各半。1.1抗炎实验1.1.1角叉菜胶所致小鼠足肿胀模型 (1)分组给药 随机分为五组,每组10只。组为control, 组为吲哚美辛，、 、组为TSPJ低、中、高剂量组。 (2)角叉菜胶所致小鼠足肿胀模型 按药理实验方法，各鼠右足趾皮下注射1%角叉菜胶(50L/只)致炎。 (3) 给药方式 本次试验

5、为预防性试验,每组连续灌胃给药10d, d10给药后1h后致炎。 (4)检测指标 在致炎后0.5, 1, 2, 3, 4, 5h时采用自制的容量测定仪,以排水法计算其右足趾体积,计算各组的肿胀度和肿胀抑制率。一、竹节参总皂苷抗炎活性实验研究前言有效性总结安全性1.1.2抗氧化实验 (1)分组给药 随机分为五组,每组10只。I组为control, 组为吲哚美辛, 、 IV、 V组为TSPJ低、中、高剂量组。 (2)给药方式和时间 本次试验为预防性试验,每组连续灌胃给药10d。 (3)检测指标 末次给药后1h摘眼球取血,静置，分离血清,分装，-20保存。按GSH-PX、SOD和MDA试剂盒要求进行

6、操作,分别检测小鼠血清GSH-PX、SOD活性及过氧化产物MDA的含量。一、竹节参总皂苷抗炎活性实验研究前言有效性总结安全性1.1.3细胞因子实验 (1)分组给药 随机分为五组,每组10只。I组为control, 组为吲哚美辛, 、 IV、 V组为TSPJ低、中、高剂量组。 (2)给药方式和时间 本次试验为预防性试验,每组连续灌胃给药10d。 (3)检测指标 末次给药后1h摘眼球取血,分离血清,-20保存。按试剂盒操作方法,检测小鼠血清IL-1 、 TNF-a含量。一、竹节参总皂苷抗炎活性实验研究前言有效性总结安全性1.2实验结果1.2.1竹节参总皂苷对角叉菜胶所致小鼠足肿胀的抑制结果 角叉菜

7、胶是常用的急性炎症模型刺激物,局部注射引起明显的毛细血管扩张、通透性增加,造成局部水肿,炎性细胞浸润,形成红肿痛热等急性炎症症状。使用吲哚美辛在致炎后0.5-4 h就减轻足肿胀,持续5小时以上,与control组相比,差异具有显著性(P0.01), TSPJ能减轻角叉菜胶所致小鼠右后足的红、肿等症状,有明显差异(P0.05或P0.01),但是起效缓慢。见表1.1。一、竹节参总皂苷抗炎活性实验研究前言有效性总结安全性1.2.2竹节参总皂昔对血清中GSH-PX、 SOD活性及MDA含量的影响 在本次试验中,TSPJ能明显提高机体抗氧化能力,GSH-PX活性和SOD活性明显提高,对自由基的清除能力加

8、强,自由基代谢产物MDA产生量明显减少,从而对机体产生较好的保护作用,这也与其滋补强壮、抗炎、消肿止痛作用相符合。见表2.4。 一、竹节参总皂苷抗炎活性实验研究前言有效性总结安全性1.2.3竹节参总皂苷对小鼠血清中IL-1, TNF-a含量的影响 如前所述,炎症反应中除了前列腺素外,IL-1、 TNF-a等其他炎症因子也参与炎症网络并且可能发挥着至关重要的作用,在实验中发现,吲哚美辛组小鼠血清中IL-1、 TNF-a水平明显下降,与control组比较,差异性极显著(P0.001),表明吲哚美辛参与了干扰IL-1、 TNF-a的生成,TSPJ组小鼠血清TNF-a水平下降,差异性显著(P0.01

9、),对IL-1影响不大,原因不明。一、竹节参总皂苷抗炎活性实验研究前言有效性总结安全性1.3竹节参总皂苷对小鼠抗炎作用实验结果分析 结果表明,竹节参总皂苷中高剂量均能明显减轻角叉菜胶所致小鼠右后足的红、肿等症状,与control组比较,50mg/kg TSPJ组在致炎后13h, 100mg/kg TSPJ组在致炎后0.54h能减轻小鼠足肿胀,有明显差异。 TSPJ三个剂量组的小鼠血清MDA明显降低(P0.05),有量效关系;竹节参总皂苷能恢复小鼠血清中GSH-PX、 SOD的活力,提示TSPJ具有减少炎症反应时自由基生成,抑制脂质过氧化反应的作用。 各类细胞因子在炎症反应中有重要功能,IL-1

10、, TNF -a能促进内皮细胞表达黏附分子,增进白细胞与之粘着,也可引起急性炎症的发热,TNF还能促进中性粒细胞聚集和激活间质组织释放蛋白水解酶。本实验中TSPJ治疗组小鼠血清IL-1 、TNF-a水平明显下降水平下降,因此抑制IL-1、 TNF-a的生成可能是竹节参总皂苷抗炎作用机制之一。 综上所述,TSPJ具有明显的抗炎功能, 抑制IL-1、 TNF-a的生成可能是竹节参总皂苷抗炎作用的重要机制。二、竹节参总皂苷对CIA大鼠组织病理学及超微结构改变的影晌前言有效性总结安全性实验动物：SPF级Wistar大鼠,体重20010g,雌雄各半。2.1 试验方法2.1.1 动物分组及处理 A.正常组

11、:注射液为无菌液体石蜡; B.模型组:制作CIA大鼠模型; C.雷公藤组:制作CIA大鼠模型,按雷公藤甲素计25g/kg灌胃给药; D. TSPJ小剂量组:制作CIA大鼠模型,竹节参总皂苷25mg/kg灌胃给药; E.TSPJ中剂量组:制作CIA大鼠模型,竹节参总皂苷50mg/kg灌胃给药; F.TSPJ大剂量组:制作CIA大鼠模型,竹节参总皂苷100mg/kg灌胃给药;2.1.2 动物模型 胶原诱导型（CIA）二、竹节参总皂苷对CIA大鼠组织病理学及超微结构改变的影晌前言有效性总结安全性2.2 观察项目2.2.1关节炎病变程度2.2.2足爪容积的测定2.2.3大鼠体重变化2.2.4免疫器官重

12、量检测2.2.5 ConA诱导的CIA大鼠脾淋巴细胞增殖反应的测定2.2.6 CIA大鼠脾淋巴细胞IL-2的诱生与检测2.2.7 CIA大鼠腹腔巨噬细胞(PM)产生IL-1、 IL-6. TNF-a的含量2.2.8 CIA组织病理组织学检测2.2.9关节超微结构的观察2.2.10关节滑膜组织中细胞间粘附分子-1 (ICAM-1)的检测二、竹节参总皂苷对CIA大鼠组织病理学及超微结构改变的影晌前言有效性总结安全性2.3 结果2.3.1 TSPJ各剂量组AI评分也随着继发性炎症的产生而升高,但与同期的模型组比较有显著性差异,提示竹节参总皂苷具有抗CIA的作用,具有量效关系,但TSPJ并无快速消除炎

13、症症状的作用,且治疗效果比雷公藤治疗组稍差。2.3.2使用TSPJ后,各剂量组肿胀程度从纵向来看,也随着继发性炎症的产生而增加,但与同期的模型组(横向比较)比较有显著性差异,提示竹节参总皂苷具有抗CIA的作用,且具有量效关系,但治疗效果比雷公藤治疗组稍差。2.3.3 CIA模型组体重增长速度减慢或停止,与正常组比较,差异有显著性(P0.05) , 雷公藤治疗组体重增长速度也出现减慢现象, TSPJ各组体重增长速度基本正常。2.3.4 CIA模型可导致机体免疫功能亢进; TSPJ都具有使亢进的免疫功能恢复正常的作用,而雷公藤则直接抑制免疫器官的发育和增长。2.3.5 ConA诱导的CIA大鼠脾脏

14、T淋巴细胞增殖反应明显低于正常对照组，TSPJ给药可以恢复CIA大鼠脾淋巴细胞功能,TPT对CIA大鼠低下的脾淋巴细胞增殖反应没有明显影响。2.3.6 TSPJ可使CIA大鼠脾淋巴细胞低下的IL-2水平恢复接近正常组大鼠水平,对照药TPT的作用不显著。二、竹节参总皂苷对CIA大鼠组织病理学及超微结构改变的影晌前言有效性总结安全性2.3.7 TSPJ大中剂量能明显抑制PM产生IL-l 、 IL-6和TNF-a;提示治疗剂量的TSPJ可以不同程度地下调致炎细胞因子水平,阻断炎症通路的恶性循环。2.3.8 TSPJ各剂量组病理切片总体情况:皮下软组织充血水肿减轻,组织间可见少许的炎性细胞浸润,关节囊

15、结构完整,关节腔内未见明显的纤维蛋白沉积,关节滑膜间可见少量炎性细胞,部分滑膜仍有一定程度的增生,软骨细胞未见明显增生现象,未见明显骨小梁溶蚀和骨胶原降解现象。2.3.9 TSPJ组:各剂量组的滑膜层细胞性内膜无增厚,细胞层数接近正常,细胞排列均匀,偶见少量淋巴细胞浸润,细胞间未见明显的胶原纤维增生,超微结构基本正常。2.3.10 TSPJ各剂量组关节滑膜ICAM-1表达数目、面积总和、积分光密度值及平均黑度值均低于模型对照组,且有着性差异(P0.05或P0.01),说明TSPJ具有降低CIA关节炎症损伤的作用,其总体效果与阳性对照药TPT无明显差异。三、结论前言有效性总结安全性竹节参具有以下

16、作用:(1)提高机体抗氧化能力,减少自由基对炎症组织的损伤;(2)具有减轻炎症组织中炎症介质PGE和LTB的作用;(3)使炎症组织中细胞因子如IL-1B、 IL-6. TNF-a等明显减少;(4)减轻炎症组织中ICAM-1的产生,使炎症部位不产生粘连;(5)对免疫系统具有双向调节作用,在治疗过程中使亢进的免疫功能下调至正常,不会产生类似雷公藤和其他免疫抑制剂导致的免疫功能减退。一、毒性作用类别药物不良反应副反应后遗效应停药反应毒性反应变态反应特异质反应致癌性致畸性致突变性毒性作用药源性疾病总结前言有效性安全性二、临床前毒理学评价主要内容急性毒性、长期毒性、特殊毒性、局部用药毒性、过敏试验、刺激

17、性试验、药物依赖性试验。总结前言有效性安全性三、竹节参皂苷粗提物毒性总结前言有效性安全性1.1 实验材料1.1.1 药物、细胞与试剂 药物：竹节参皂苷提取物 细胞：小鼠单核巨噬白血病细胞株RAW264.7 试剂： DMEM 高糖培养基、胎牛血清、一氧化氮(NO)检测试剂盒1.2 实验方法1.2.1 细胞培养 RAW264.7 细胞株的复苏：用75%酒精擦拭超净工作台,紫外线照射超净工作台30 min,从液氮罐中取出冻存管,迅速将冻存管放到已经预热的水浴锅(37 )中迅速解冻,不断摇动,待冻存管内液体完全溶解(控制在1 min 内),取出用酒精棉球擦拭冻存管外壁,再拿入超净台内,将冻存管内的液体

18、转入15 mL离心管,加入2 倍体积含10%胎牛血清的DMEM 培养基,800 r/min 离心5 min,弃去上清液,重悬细胞,接种到培养瓶中,37 、5% CO2 条件下培养。传代：待细胞长至90%后,从培养箱内取出细胞,小心吸出旧培养液,用PBS 清洗,加入3 mL 10%胎牛血清的DMEM 培养基,用细胞刮棒沿一个方向轻轻将细胞刮下来,将细胞悬液转移到15 mL离心管中,800 r/min离心5 min,弃去上清液,加入培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液,分装入培养瓶后,放入培养箱37 、5%CO2条件下培养。冻存：当细胞长至80%90%时,将细胞收集起来,将胎牛血清与二甲基亚砜(

19、DMSO)按照9 1的比列配制好冻存液。然后每管中加入2 mL 冻存液转移至冻存管中,依次放在4 中40 min、-20 中40 min、-80 过夜,第2 日转移至液氮灌中保存。竹节参皂苷粗提物不仅毒性小,而且其抗炎效果最好。三、竹节参皂苷粗提物毒性总结前言有效性安全性1.2.2 RAW264.7 细胞活力测定 将RAW264.7 接种于96 孔板,细胞数为105 个/mL,每孔100 L,贴壁后,设置调零孔(只有培养液)、正常组、给药组,给药浓度为5、10、20、40、80 g/mL,每组4 个复孔,24 h 后吸取上清液,在每孔中加入含MTT 的培养液,继续培养4 h,然后将上清去掉,每

20、孔加入150 L DMSO,置摇床上低速震荡10 min,使结晶充分溶解,在酶联免疫检测仪490 nm 处测量各孔吸光度。1.2.3 RAW264.7 细胞一氧化氮释放量测定 将RAW264.7 接种96 孔板,细胞数为105 个/mL,每孔100 L,贴壁后,同时加入不同提取工艺的竹节参皂苷(浓度为10、1 g/mL)和1 g/mL LPS 作用,设为空白组、LPS 组、LPS竹节参皂苷组,每组4 个复孔,24 h 后,取上清液50 L,依次加入Griess和Griess各50 L, 37 恒温箱中反应30 min,在酶联免疫检测仪540 nm 处测量各孔吸光度。1.3 统计学方法 采用SP

21、SS13.0 统计软件进行分析。所有数据均以xs 表示,采用方差分析进行多组间差异比较,以Dunnett-t 检验比较两组间均数的差异。P 0.05 表示差异有统计学意义。在炎症反应中,NO 是判断炎症最基本的指标四、竹节参提取物对大鼠长期毒性总结前言有效性安全性 长期毒性动物实验一般指连续给药14d以上。本实验观察竹节参提取物灌胃给予大鼠90、180 d 及恢复30 d 的毒性反应，考察大鼠长期给药的安全性，为竹节参临床用药安全性评价提供实验依据。2.1 实验材料2.1.1 药物、动物 药物：竹节参 实验动物： SPF 级SD 大鼠，雌雄各半，体质量( 150 10) g2.2 实验方法2.

22、2.1 竹节参提取物的制备 将竹节参干燥根茎粉碎后，用60%乙醇回流提取3 次后，回收乙醇，合并滤液，浓缩，得到竹节参提取物，提取率为25.8%。2.2 .2动物分组及给药方法 将96 只大鼠按体重随机分为4 组，每组24 只，雌雄各半，分别为竹节参提取物低、中、高剂量( 生药3 2、6 4、12 8 gkg1 ) 组，相当于临床成人用量的25、50、100 倍，另设对照组。适应性饲养1周后，对照组给予蒸馏水，给药组给予相应剂量的竹节参提取物。给药体积为1.0 mLkg1 ，每天1 次，每周6 次，连续给药180 d，停药后恢复30 d 。分别于给药第90、180 d 以及停药恢复30 d，每

23、组各取8 只大鼠， 20%乌拉坦麻醉( 0。7 mL/100 g) 后于腹主动脉取血，分离血清做血液生化指标检测; 同时取大鼠主要脏器进行系统观察和组织病理学检查。四、竹节参提取物对大鼠长期毒性总结前言有效性安全性2.2.3 大鼠一般状况、进食量及体重观察 每天观察大鼠一般状况，包括外观体征、行为活动、食欲、大小便; 每天记录大鼠进食量; 每周称量大鼠体重1 次。2.2.4 血液学检查 大鼠腹主动脉取血后检测凝血酶原时间( PT) 、白细胞计数( WBC) 、红细胞计数( RBC) 、血红蛋白( Hb) 、红细胞压积( HCT) 和血小板数目( PLT) 等。2.2.5 血液生化学检查 大鼠腹

24、主动脉取血，3000 rmin1离心10 min 取上层得到血清，用全自动生化分析仪检测血清中谷丙转氨酶( ALT) 、谷草转氨酶( AST) 、总胆红素( TBIT) 、总蛋白( TP) 、白蛋白( ALB) 、球蛋白( GLO) 、总胆固醇( TCHO)、葡萄糖( GLU) 、尿素氮( BUN) 等主要生化学指标。2.2.6 系统解剖、脏器指数检查和组织病理学检查 大鼠处死后，立即取出心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、脑、睾丸、附睾、子宫、卵巢、胸腺、肾上腺，称重后计算脏器指数。另取胃、十二指肠、甲状腺、胰腺、附睾、前列腺，与心脏等组织一同放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h 后，转入70%乙醇中

25、，进行脱水、包埋，组织切片、HE 染色，于光镜下进行组织病理学检查。2.2.7 统计学分析 所有实验结果的数据以均数 标准差( x s) 表示，数据分析采用SPSS17 0 统计软件，以单因素方差分析( one-way ANOVA) 并进行多组间差异比较，行Dunnett-t检验，暂未考虑调整显著性水准。四、竹节参提取物对大鼠长期毒性总结前言有效性安全性2.3 结果2.3.1 对大鼠一般状况、进食量和体重的影响 给药期和恢复期间，各组动物外观正常，活动自如，各剂量组大鼠体重、摄食量和粪便等均未见明显异常。大鼠体重呈稳定增长趋势，与对照组比较，各剂量组大鼠无显著性差异( 见表1) 。结果提示竹节参提取物对大鼠一般状况、进食量和体重的进食量和体重无明显影响。四、竹节参提取物对大鼠长期毒性总结前言有效性安全性2.3.2 对大鼠血液学指标的影响 实验结果如表2 所示，给药期间，与对照组比较，竹节参提取物中、高剂量组WBC 和HCT 均明显增加，具有统计学意义( P 0.0