模拟移动床文献翻译

1、姓名：王方 学号：2011021816 专业：应用化学运用具有记忆效应的色谱柱组成模拟移动床分离氨基酸对映体Markus Fuereder, Sven Panke, Matthias Bechtold摘要替考拉宁苷元手性柱在有水作为流动相的条件下能分离氨基酸对映体，加水时考虑到了氨基酸的水溶性。因此这种固定相可以作为需要大量进样的制备规模的手性分离提供一个选择。然而，在现实的SMB系统中，当注入大量的氨基酸溶液后，柱子的记忆效应是一个需要进一步考量的因素。将注入大量的氨基酸溶液前后的色谱柱的保留时间进行对比可以看出，大量的样品溶液可以活化色谱柱，提高样品的保留时间。这种记忆效应可以通过大量的不

2、含溶质的流动相冲洗色谱柱来消除。明显地，在设计SMB系统的操作参数时，绘制吸附等温线时必须考虑到这种记忆效应。在这篇文章中，我们运用一种微扰法来描述SMB系统中固定相的这种现象。根据由此画出的吸附等温线确定了SMB的操作条件，我们发现根据模型计算出的纯度与实验得到的纯度吻合较好，证明这种吸附等温线可以很精确的描述SMB系统的运行特点。连续三天的SMB操作得到了较为稳定的产品纯度（除了由于温度的改变导致的纯度波动外）证明在活化状态下的吸附行为是不随时间而改变的，用这些柱子组成模拟移动床进行长期稳定的SMB操作在理论上是可行的。1， 简介在过去的几十年中，模拟移动床在精细化学和药物化学手性分离方面

3、已得到广泛的应用。具有更高手性选择性的固定相已经商品化，大量的寿星化合物运用SMB系统成功分离。多亏有了更加有效的理论工具如三角形理论、计算机控制的过程模型的发展，才能更加直接的通过吸附等温线设计SMB的操作条件。在精细化学中，运用系统分离外消旋氨基酸是非常重要的一环，由于氨基酸不溶于正相流动相，所以对手性固定相的选择提出了一些挑战，而且流动相中必须含有大量的水。在这篇文章中，大患糖肽手性固定相，尤其是替考拉宁和替考拉宁苷元作为手性选择剂，有大量的氨基酸得到有效分离的例子，因此其是一种非常诱人的分离氨基酸的手性固定相。以前我们详细调查了这种替考拉宁苷元手性固定相是否适合于SMB系统手性分离。我

4、们发现TAG柱显示出记忆效应，说明了色谱柱的吸附行为依赖于柱子过去的载样量。简单地说，就是色谱柱用大量的样品溶液过载前后的保留时间是不同的。在所有分离的氨基酸以及所有分离条件下，都观察到这种现象。尤其是在分离甲硫氨酸时，后出峰组分的保留时间的偏移可以达到25%。有趣的是，在过载之后的色谱柱选择性比过载前要好，证明用大量的溶质冲洗色谱柱可以活化固定相。当用大量的不含溶质的流动相冲洗色谱柱后，它的吸附行为缓慢回到初始状态，因此这种记忆效应是可逆的。然后，大量的氨基酸在SMB系统循环的吸附脱附证实在这种SMB操作在理论上是可行的。然而，当设计用TAG柱分离氨基酸的SMB系统时，由于在过载和再生情况下

5、色谱柱的区别很大，因此必须考虑记忆效应。如图1所示。有记忆效应的色谱柱偶尔有过报道，尤其在多糖手性柱中，在这种情况下，吸附行为的改变是由于流动相的改变引起，而不是由溶质引起，这为SMB的设计提供了更加全面的考虑。这篇文章的目的是（）寻找一个合适的吸附等温线的方法，能够描述这种具有记忆效应的SMB系统（）证实用这种具有记忆效应的色谱柱组成SMB系统是可以长期稳定操作的。图1 （a）严重过载情形下的流出曲线 （b）用40ug/L的甲硫氨酸平衡前后流出曲线2， 理论2.1 微扰法在竞争吸附等温线的绘制中，尤其是对映体手性分离中，微扰法是一种非常好的方法。简单的来说，它是基于确定组成的溶质溶液形成平台

6、，然后通过少量的溶质溶液对这种平台进行扰动，在不同的溶质浓度和流动相浓度下，在流出曲线上会产生一些正的峰或负的峰。在对映体洗脱时，在流出曲线上会形成两个峰，通过保留时间以及下式（1）中的两个根，可以推断出吸附等温线中的吸附参数。其中C1和C2分别为对映体在流动相中的浓度，q1和q2为对映体在固定相中的浓度。 （1）求出公式（1）的两个根后，带入公式（2）中， （2）微扰法中各组分的保留时间可以通过下面的公式用柱子的死时间表示， （3）然后，在已知吸附等温线类型的情况下，相应的吸附参数可以通过上述式子推断出来。在这种情况下，我们采用双吸附竞争型吸附等温线，吸附为点和有相同的吸附容量。 （4）2.

7、2 SMB用三角形理论选择SMB系统的操作点，全分离区域是二带三带流速，的函数。J区的流量可以通过算出来，切换时间，床层空隙率，柱的体积V和额外柱体积 （5）如果想要了解图的细节和三角形理论，请参考Mazzotti的工作。为了快速确定可分离区域，可以使用简捷算法。单次的SMB运行可以用文献【21】描述的具体的SMB模型。这个具体的SMB模型考虑到了（）浓度曲线随时间的动态发展（）每一种对映体的具体的动力学数据（）在SMB系统中具体的柱的构象。3， 实验3.1 化学试剂除了特别标明，甲硫氨酸，醋酸铵和其他试剂都来自Roth公司（瑞士）或者是Sigma-Aldrich公司（瑞士）。乙腈来自Chem

8、ie Brunschwig（瑞士）。所有的有机溶剂都是色谱级的。去离子水是用一台TKA-Genpure机器制的的。3.2 色谱柱我们用一根（100mm×4.6mm,ID），粒径为5um的色谱柱用于分析。五根制备柱（100mm×10mm，ID）用的是16um的粒径床层。这些色谱柱都来自Sigma-Aldrich公司（瑞士）。制备柱在使用之前都已经被不同程度的使用过。3.3 分析所有分析实验包括吸附等温线的绘制都是在22度时在一台使用二极管阵列检测器的安捷伦1100高效液相色谱仪上进行的。使用含重氢的水合折光检测器来测定柱子的死时间。定量测定L-甲硫氨酸和D-甲硫氨酸使用的分析

9、方法是90/10%(v/v)50nmol醋酸铵pH=6.0/甲醇作为流动相，流速1.5ml/min。3.4 微扰法微扰法的步骤是用已知浓度的样品溶液来逐步饱和色谱柱，然后进行微扰实验。微扰实验是通过注入10uL的与平台浓度不同的样品溶液完成。分别记录0-12g/L的对映体溶液的15个浓度平台的微扰保留时间。在这篇文章中用到不同的浓度平台组合。其中“中间平台法”是（单位为g/L的对映体甲硫氨酸）：0/8/2/8/1.6/8/1.2/8/0.8/8/0.4/8/0.2/8/0.16/8/0.12/8/0.08/8/0.04/8/0.02/8/0/8/4/8/12/8/0；“无中间平台法”：0/2/

10、1.6/1.2/0.8/0.4/0.2/0.16/0.12/0.08/0.04/0.02/0/8/4/12/0；“从低到高法”：0/0.02/0.04/0.08/0.12/0.16/0.2/0.4/0.8/1.2/1.6/2/4/8/12/0；“从高到低法”：12/8/4/2/1.6/1.2/0.8/0.4/0.2/0.16/0.12/0.08/0.04/0.02/0。补充材料里有一个图解说明和一个关于浓度平台的表格。在进行微扰实验之前，每个色谱柱都用50/50(v/v)的50mmol醋酸铵/乙腈用4ml/min的流速活化30min。然后用90/10(v/v)50mmol醋酸铵/甲醇冲15mi

11、n。3.5 SMB系统的建立和实验SMB系统是基于一个改装的AKTA基本系统，有两台P-900泵单元，五个多通阀，一个紫外/可见检测器组成。一个泵单元用来提供进料和流动相，另一个泵用来提取液和提余液的流速。每一个泵都与一个多通阀连接。第五个多通阀将提取液从四带中导出来。每两个柱子之间都有一个止回阀都是用来正确引导流动相的流向的。SMB系统是由相同的单元组成的，每个单元如图2所示。图2 系统单个柱系统的构造系统每个部分的额外的柱体积由每个区的柱数决定，一个柱的额外柱体积为0.1mL。提余液的浓度用235nm的紫外光检测。一旦达到平衡状态，提取液和提余液的纯度就可以测量了。到达平衡状态的时间通过具

12、体的SMB模拟来进一步确认。每个样品都收集两个循环的量，然后用HPLC进行定量分析。流出速率通过收集另外一段时间的流体然后称量计算得到。进入系统的料液在输送进去之前都要经过脱气处理。另外，在进入SMB系统前，所有料液还要经过一个在线脱气装置。我们用一个改进版本的UNICORN软件来控制泵系统，多通阀系统和检测器系统。在SMB系统运行之前，这个系统用50/50(v/v)的50mmol醋酸铵/乙腈用4ml/min的流速活化30min。SMB系统的运行用两个流动相组成方案：90/10和75/25(v/v)50mmol醋酸铵/甲醇组成。每种方案下，进料为10g/L的外消旋甲硫氨酸溶解于相应的流动相中。

13、所有的SMB操作都在1-2-1-1的柱分布系统下进行。3.6 模拟和拟合步骤为了通过微扰法获得吸附等温线，我们运用了基于模型的实验方法。通过优化演算法来缩小实验与模型的数据的差距，来获得实验参数。这个优化过程通过MATLAB软件来完成，通过优化方程“fminsearch”来确定有最小偏差的参数。这些SMB模型在MATLAB上实行。4， 结果和讨论当SMB系统中运用具有由溶质引起的记忆效应的柱子时，可以做两个假设：（）在一定时间的操作之后，吸附行为的发展仍然没有大的变化（）可以用一个合适的吸附等温线来描述这种SMB的稳定状态。我们首先假设第二点成立，然后我们可以在此基础上在一个比较合适的操作点确

14、认第一点的正确性。4.1 方法的发展只有考虑到热力学和动力学的对色谱过程的精确描述，才能比较好的设计SMB的模型和操作条件。当质量转移比较慢时，会引起流出浓度曲线的展宽，进而会影响分离情况。原则上，记忆效应引起的保留时间偏移可以认为是吸附等温线和质量转移动力学的共同作用的结果。然而，有一些推论证明后者没有改变多少。首先，保留时间的偏移并不能用质量转移动力学做一个合理的解释，因此可以推断出吸附等温线是是记忆效应的主要来源。其次，最初的浓度流出曲线与再生后柱子的流出曲线差异很小，显示出质量转移动力学并没有发生大的改变。根据再生柱子的浓度曲线做出范第姆特曲线也进一步证明了之前的操作是非常正确的。在如

15、此高的塔板数的情况下，在SMB系统中的质量转移阻力适中，然后SMB的运行对质量转移的轻微变化并不敏感。然后，就可以假设，从再生的柱子获得的质量转移动力学对活化状态的柱子的描述也是很精确的。4.1.1 绘制吸附等温线的方法的选择吸附等温线有一系列不同的绘制方法，每一个都有各自的优点和缺点。当存在这个特殊的具有记忆效应的柱子时，需要研究固定相的性质，这样才能在绘制吸附等温线之前确定类似SMB的状态。这就限制了对那些基于浓度平台的测定方法的选择，比如说微扰法，逆方法，前沿分析法。当多组分的流出曲线需要把每个组分的贡献都计算出来时，前沿分析法在实验时是比较昂贵的，流出曲线中的成分还需要额外的HPLC分

16、析。逆方法包括直接来自逆方法的带有一些信息的曲线方法和来源于HPLC流出曲线的逆方法。由于介绍过的逆方法获得的实验信息量大于一般的逆方法，因此可以用更少的实验来获得。另一方面，这种曲线分析方法在数量上是比较贵的。在我们的研究中，我们选择微扰法，它不需要额外的HPLC分析，可以快速从实验数据算出吸附等温线。而且，不需要校正检测器，纯对映体的消耗比较少，因此需要消耗更多的外消旋体，但是由于本来消耗对映体的量就不多，因此这对我们是可以接受的。4.1.2 在微扰法中的记忆效应在没有记忆效应的SMB系统中，浓度平台的不同组合，不同的浓度安排顺序，希望不会对溶质的保留时间产生影响。相反地，在具有记忆效应的

17、柱子上的保留时间极度依赖于柱子的以往使用的历史。SMB系统可以通过大量溶质的循环吸附和脱附来描述。由于溶质会活化柱子，所以必须保证这种状况在已定的吸附等温线模型之中。但是比较有争议的是，随着SMB的模拟程度的增加，估计步骤的精度也应该跟着增加。然而，准确的SMB的浓度流出曲线只有在吸附等温线和操作点知道时才能进行估计，但是吸附等温线和操作点在此时显然是不知道的。然后，我们引入了一个额外的浓度平台来建立微扰法的浓度平台的大小和顺序，用来近似模拟SMB的实际情况。具体情况是，我们选择一个浓度平台8g/L作为这个额外的浓度平台，平台时间是10min，这对SMB的实际情况是比较符合的，其中当SMB中进

18、料浓度是25g/L（溶解度限）时，其中流动相组成是90/10的50mM NH4Ac pH6.0/Methanol。4.2 重现性和柱子的异质性在评价绘制吸附等温线的方法是否有用前，必须对柱子的重现性和异质性进行考察。由实验步骤和柱子异质性引起的误差引入到SMB系统中，成为了误差的来源，除此之外，这个描述记忆效应的方法存在潜在的缺点。4.2.1 重现性为了调查这种这种方法的鲁棒性和连续生产的重现性，在相同的状态下用同一根柱子分三次运行。先流出组分的保留时间的平均值是5.2min，相对标准误差为0.2%，后流出组分的保留时间的平均值是7min，相对标准误差是0.38%。微扰法保留时间的相对误差相对

19、于记忆效应引起的偏差来说小得多。这也表明在负载情况下的吸附行为是可以重现的。除此之外，现有模型的实验误差是相当小的。4.2.2 柱子的异质性柱子的异质性是SMB操作的精确预言的一个重要部分。通常只用一根柱子的热力学参数来模拟SMB。Mihlbachler等证实随着柱子的异质性的增加，可分离区域是减少的。当吸附行为发生在非线性区域时，这种现象尤为明显。因为这个SMB系统中运用的柱子在使用前都被不同程度的用过，所以我们这些柱子的热力学性质的差异。这个复杂分析的第二个目的是找到一根特定的柱子来代表所有的柱子绘制吸附等温线。然后当对其他状态下的SMB的表现进行评价时，这个设计可以用一根柱子来绘制吸附等

20、温线，而不需要所有的柱子。然后，我们对所有的柱子进行微扰实验。如图3所示：图3 5根柱子的微扰实验的结果这5根柱子的先流出组分的保留时间平均偏差为1.0%，后流出组分的保留时间的平均偏差为1.3%。柱子的异质性在低浓度时表现得尤为明显。当流动相中溶质浓度为0时，第二个峰的平均相对误差为3.4%，当溶质浓度达到最高的12g/L时，即单个异构体的浓度是6g/L时，两个峰的相对标准偏差都只有0.8%。这5根柱子的平均死时间为3.42min，平均相对标准误差是1.0%，然后可以算得平均空隙率是0.65。通常保留时间的区别来源于装柱过程中固定相的装填的不同。然而，这里的结果显示保留时间的差异不能用装填过

21、程中空隙率的区别来解释。而且，我们没有观察到非保留组分与保留组分的保留时间之间有什么关系。这显示柱与柱之间的波动来源于固定相本身。先前提到，这些柱子在组成SMB之前都被不同程度的用过，因此在保留时间上有一些轻微的下降。4.3 基于微扰法的SMB设计和SMB系统的操作4.3.1 参数推断然后，用微扰法推断出的保留时间可以用来绘制吸附等温线，用来设计SMB。第一步是考察哪一种吸附等温线可以很好的模拟这个过程。前期的在吸附机理的调查显示替考拉宁柱分离甲硫氨酸时有两个手性选择位点。然后，我们成功地将一个热力学一致的双吸附类型Bi-Langmuir吸附等温线运用于HPLC流出曲线的描述。在相关的抗生素的

22、柱上，这种吸附等温线已经被报道过很多次，在某些情况下，运用简化的Bi-Langmuir吸附等温线，这种等温线有更少的吸附参数。结果，我们试过很多种不同的吸附等温线，其中含有近似一致的Bi-Langmuir吸附等温线（含有6个参数）和一致的Bi-Langmuir吸附等温线，然后还有一个近似一致的具有两个手性选择位点的三吸附Langmuir吸附等温线。用近似一致的模型获得的数据与具有更高参数的模型获得的实验数据没有明显的区别，然后我们运用了近似一致的双吸附Bi-Langmuir吸附等温线来用这五根柱子进行微扰分析。，如图4所示，是柱5保留时间和平均保留时间的比较。图4 最佳模型和柱5的实验数据的比

23、较（实线为最佳模型的数据，圆点为柱5的数据）然后，我们根据五个柱子的平均保留时间算出了平均参数（如表1所示）。获得的参数表明，在双吸附Bi-Langmuir吸附等温线中的两个吸附位点的基本不同点，一个吸附位点有高的饱和容量，小的Langmuir常数；另一个吸附位点有低的饱和容量，大的Langmuir常数。后面一个吸附位点的推测出的参数的相对偏差相对前者来说比较高，这也证实了在小浓度时的保留时间的偏差要大于大浓度时的保留时间的偏差。在低浓度时，第二个吸附位点还没有过载，对吸附等温线的影响较大。值得注意的是，从推算出的吸附参数可以推断出这两个吸附位点都是手性选择性吸附。然后，我们运用的吸附等温线应

24、该是对实际情况比较准确的一个描述，因为非手性选择性作用在样品的保留中是普遍存在的。表1 根据5根柱子的保留时间和平均保留时间算出的热力学参数4.3.2 实验和模拟的纯度比较4.3.2.1 甲醇的含量为10%的情况。为了评价的设计方案的可行性，选出最具代表性的柱子来绘制吸附等温线，通过已获得的吸附等温线获得的操作程序与实际的SMB的操作结果进行比较。通过简捷算法可以算出完全分离区的面积，然后运用到所有的柱子中。这种方法依赖于色谱的平衡理论，但是忽视了非重要因素如质量转移阻力的影响。然而，已经证明对于理论塔板数大于100的系统来说，偏差是很小的，用简捷算法来估算整个过程是比较准确的。为了确定一个比

25、较准确的浓度范围，全分离区域的面积是通过平衡理论方法在不同的进料浓度条件下算出来的。在高浓度时，全分离区域的面积变得很小，超过了SMB稳定操作的范围。既要考虑到效率又要考虑到鲁棒性，因此进料浓度确定为10g/L。由于柱子的异质性，根据不同柱子的保留时间算出的可分离区域的位置有一些不同（如图5所示），但是没有很大的区别。图5 根据不同柱子算出的吸附等温线参数下的可分离区域这表明吸附参数的不同并不会对以后的可分离区域的推导产生很大的影响，但是确实是柱子异质性的一个反映。基于这个可分离区域，我们选择了不同的操作点，从提余液纯萃取液不纯到提余液纯萃取液纯到提余液不纯萃取液纯的区域都有。在所有的12个操

26、作情况下，四个在所有柱子的全分离区域的点得到的产物的纯度没有很大的区别。通常情况下，所有的操作情况下，试验数据与简捷算法算出的结果吻合很好。然而，从简捷算法获得的信息很有限，不能获得提余液和提取液的纯度。如果用一个更具体的SMB模型，这个模型考虑到了动力学的影响，实际的柱的构象的影响，色谱柱的大小和维度的影响，就可以获得更多更高级的信息。然而，为了操作起来更简捷，我们将所有的柱子都用了同一个吸附等温线。然后，我们总结了从范第姆特方程得到的非理想状态的状态（线性LDF模型，质量转移系数轴向扩散系数通过通过轴向扩散因子A计算得到，其中为流动相的线速度）。从更具体的SMB模型得到的流出物的纯度与实验

27、得到的数据吻合很好。这也证明了我们最初的假设就是质量转移动力学在过载状态下并没有发生很大的改变。4.3.2.2 甲醇的含量为25%的情况这个研究的一个目的就是发展一个快速和比较可靠的吸附等温线的方法，来绘制代表一些柱子的一个柱子的吸附等温线。为了找出这个最具代表性的柱子，我们（1）比较了所有的柱子的保留时间和平均保留时间（2）比较了所有柱子的热力学参数和由平均保留时间算出的热力学参数进行比较。两种方法都表明柱5是最能代表所有柱子的色谱柱。这个代表性的柱子的全分离区域与由平均保留时间得到的可分离区域的比较如图6所示：图6 柱5与由平均保留时间算出的可分离区域的比较（实线为柱5，虚线为平均保留时间

28、算出的可分离区域）初步的试验表明甲硫氨酸的保留时间和选择性都会随着流动相中甲醇含量的增加而增加。为了确认这些结果并进一步验证目前吸附等温线绘制方法的合理性。我们运用柱5并在含25%甲醇的流动相情况下对其进行微扰分析（结果如表3所示）。表3 柱5在含25%甲醇的流动相的微扰法下算出的吸附参数确实，当比较含10%甲醇和25%甲醇两种条件下的可分离区域的面积时（如图7所示），25%情况下面积确实要大一些，这表明具有更大的产量和更高的鲁棒性。我们在含25%甲醇情况下做了两组实验：一个是在可分离区域，另一个是在纯提取液区域。图7 柱5在含有10%和25%甲醇情况下的可分离区域的比较获得的实验纯度（如表4

29、所示）与具体的SMB模型获得的纯度吻合很好，更加证实了当前吸附等温线绘制方法的正确性。表4 25%甲醇情况下两个操作点的获得数据的比较4.4 不同的平台搭配的吸附等温线比较就如早期讨论过的一样，不同进样浓度的搭配可以看做是SMB模型的一种近似。有了来自吸附等温线的数据，我们就能在能更好分离的全分离区域估算SMB的浓度曲线。这个吸附等温线方法理论上可以更好的代表SMB的状态，因此这个吸附等温线方法可以提高SMB的可预测性。然而，至少在我们的操作条件下，这个预测的精度是比较准确的。另一方面，另一种比较简单的不含中间浓度平台的方法可能也能获得一个好的吸附等温线。为了检查这种方法是否有意义，我们实施了

30、三种简化了记录方式的简化方法（1）第一种记录方案与“中间浓度平台法”有相同的浓度平台，但是没有中间浓度平台（“无中间浓度平台法”）（2）一个阶梯的从低到高的浓度方案（从低到高法）（3）一个阶梯的从高到低的浓度方案（从高到低法）。我们用完全相同的初始值来估算吸附参数，然后比较了各种方法下的全分离区域和产物纯度。从“无中间平台法”和“从低到高法”获得的结果非常相似（如图8所示）。在这两种情况下，全分离区域的面积要比“中间平台法”获得的全分离区域的面积小。有趣的是在“中间平台法”下，实验获得的残留物的浓度与由模型推算出的浓度是可以相比拟的（如表5所示）。图8 由四种不同方法获得的可分离区域，其中实线

31、：中间平台法；点线：无中间平台法；虚线：从高到低法；点划线：从高到低法。然而，“中间平台法”对提取液和提余液的浓度估计都太过乐观（基于图来说，就是可分离区域的面积太大）；由“从低到高法”和“无中间平台法”对提取液的浓度估计太过乐观，对提余液的浓度估计太过悲观（从图来说就是三角形区域太往下偏了）；这些结果的区别也从微扰保留时间的偏差上可以看出来。特别地，在低浓度时的保留时间上，“中间平台法”明显高于“从低到高法”和“无中间平台法”，这表明记忆效应在后两个方法上是比较不明显的。三角形位置的偏移可以认为是因为参数估计的不准确，全分离区域的过大估算可以认为是因为柱子的异质性导致的。因此，“中间平台法”是更合适的。表5 不同平台搭配方法获得的产品纯度和实验获得的纯度的比较我们发现“从低到高法”能获得与“中间平台法”相似的结果（如图8所示），表明这个方法可以取代实验上更加昂贵的“中间平台法”。通过这种方法，柱子在开始相当长一段时间内会注入一些高浓度的溶质溶液来活化柱子。其后的浓度平台都是都是通过从高浓度解吸到低浓度来实现的，尽管相对于