中药千里光不同剂量及其配伍后毒副作用的... - 上海中

1、中药千里光不同剂量及其配伍后毒副作用的观察张超群 孙莉 孔祥蕾 杨滢瑶 李倩倩指导老师：方肇勤 卢文丽上海中医药大学2004级中医临床七年制、2007级中医，201203 摘要 目的：观察不同剂量中药千里光，及其配伍后对小鼠肝脏可能存在的毒副作用。方法：将小鼠随机分为空白对照组、千里光小剂量组、中剂量组、大剂量组、千里光配伍组及配伍药组共6组，灌胃7天后检测肝脏指数、肝脏生化指标ALT、AST及肝脏形态学等指标，分别于实验的1、4、7天检测体重。结果：实验中正常对照组意外死亡小鼠1只、千里光大剂量组意外死亡小鼠2只；与正常对照组比较，各组体重指数、肝脏指数以及生化指标AST差异无统计学意义（P

2、>0.05）；千里光中剂量组及配伍组生化指标ALT明显升高，千里光小剂量组生化指标ALT明显降低（P<0.05）。结论：大、中、小剂量千里光、千里光配伍后，以及配伍药物未见显著的肝脏毒副作用。关键词 千里光；肝毒性；ALT；AST；病理近年来，中药的毒副作用已经成为国内外关注的热点。而一些中药，如千里光的毒副作用报道，最早可以追溯到1920。迄今已有多篇文献报道了千里光属所引起严重肝损害并伴有死亡的临床案例，其死亡率甚至高达271！千里光在中医临床上处方不是很多，但是以其组方的中成药品种却数量较多。临床剂量的千里光是否具有肝脏急性损伤的毒副作用、配伍后作用如何？本实验拟通过观察检测

3、不同剂量的千里光对小鼠肝功能和病理的影响等研究，初步明确千里光及配伍后是否具有显著的毒副作用。1材料与方法1.1 材料实验动物昆明种小鼠，雌性，72只，1924g，清洁级仪器及设备养生锅、电子秤、DK-S22型电子恒温水浴锅、722光栅分光度计、双面刀片、眼科镊、组织镊、眼科剪、解剖剪、染色架、染色缸、广口瓶、恒温水浴锅、生物切片、恒温箱、电子天平、脱水蓝、显微镜、NIKON数码相机药物与试剂千里光（上海青浦产）、白菊花、石决明、甘草10%福尔马林、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、二甲苯、苏木精、甘油蛋白 、盐酸酒精、伊红丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（国食药监械（试）字2

4、004第3060018号）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（国食药监械（试）字2004第3060020号） 药物及其剂量（1）千里光小、中、大剂量组。千里光分别为20g、40g、80g。（2）千里光配伍组。千里光、白菊花、石决明、甘草各20g，合计80g（相当于千里光大剂量的用药量）。（3）配伍药组。白菊花、石决明、甘草各26.7g，合计80g（相当于千里光大剂量的用药量）。 1.2方法生药鉴定：向我校生药教研室崔亚君老师请教。动物分组及处理将小鼠随机分成六组：空白对照组、千里光小剂量组、千里光中剂量组、千里光大剂量组、千里光配伍组、配伍药组，每组12只。（1）空白对照组：第17天，每天次

5、灌胃自来水0.5ml/只。（2）千里光小剂量组。第17天每天1次灌胃相应中药水煎液0.5ml/只（0.1g生药）。以人60kg，30g/日，及小鼠体重20g计，为成人公斤体重的10倍。（3）千里光中剂量组。第17天每天1次灌胃相应中药水煎液0.5ml/只（0.2g生药）。为成人公斤体重的20倍。（4）千里光大剂量组。第17天每天1次灌胃相应中药水煎液0.5ml/只（0.4g生药）。为成人公斤体重的40倍。（5）千里光配伍组。第17天每天1次灌胃相应中药水煎液0.5ml/只（总药量0.4g生药）。（6）配伍药组。第17天每天1次灌胃相应中药水煎液0.5ml/只（总药量0.4g生药）。指标观测（1

6、）一般情况 包括第1、4、7天动物体重、死亡情况等等。（2）生化指标 最后一次给药后禁食16小时，眼球采血收集和分离小鼠血清，测定丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）。（3）肝脏指数 第8天取小鼠完整肝脏拍照、称重，计算肝脏指数。（4）肝脏病理切片观察 病理切片制作方法（1）固定与修块取小鼠肝脏块投入10甲醛溶液，固定适当时间后予以修快成4mm³大小方形，继续固定约24h，入75乙醇。（2）脱水与透明75乙醇过夜85乙醇60min 95乙醇（）30min95乙醇（）30min100乙醇（）30min 100乙醇（）30min 1/2二甲苯（乙醇与二甲苯等体积）20

7、min 二甲苯（）20min 二甲苯（）20min（3）浸蜡、包埋与修块浸蜡： 60恒温箱放置120min。包埋：采用纸盒。包埋时将60的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将各组织块按一定的顺序排列好，使切面朝下。修蜡块：待纸盒内蜡凝固后。将蜡块取出，用刀片将其修成梯形，组织块与蜡块边缘之间的距离不得小于2mm。（4）切片切片厚约5m，将切片在50左右水浴中展开。用涂有甘油蛋白的载玻片从水浴中捞取切片，每个组织块捞片2张。放入37烘箱中过夜。过夜后，将载玻片置于玻片架上，预备染色。（5）染色二甲苯（）15min二甲苯（）15min100乙醇2min95乙醇（）1min95乙醇（）1min75乙醇2m

8、in蒸馏水浸洗1min苏木精30s自来水冲洗1min。伊红（着色即可）蒸馏水浸洗 1min75乙醇 2min95乙醇（）1min95乙醇（）1min100乙醇2min二甲苯（）2min二甲苯（）35min中性树胶封片 数据处理方法实验数据用SPSS11.5软件进行分析，组间比较采用单因素方差，检验水准=0.05。2实验结果2.1生药鉴定结果经生药教研室崔亚君老师鉴定，确认所购中药千里光饮片为菊科植物千里光。2.2 一般情况实验中，正常组意外死亡1只，千里光大剂量组意外死亡2只在体重方面，与正常对照组比较，3个检测点各组别体重无统计学差异（P>0.05）。提示各组药物对小鼠体重没有显著的影

9、响。见表1和图1：表1 各组体重变化及比较（±S，g）组别1d4d7d正常组（n=11）21.1 ±1.225.8 ±2.526.1 ±3.2千里光小剂量组（n=13）21.4 ±1.426.3 ±1.825.8 ±2.3千里光中剂量组（n=13）21.3 ±1.526.1 ±1.928.0 ±1.8千里光大剂量组（n=11）21.7 ±1.426.2 ±2.326.2 ±3.5千里光配伍组（n=12）21.5 ±1.426.2 ±1.526.6

10、 ±2.5配伍药组（n=12）21.3 ±1.726.6 ±2.027.3 ±2.6图1 各组小鼠体重变化* 图中小、中、大剂量分别代表千里光小、中、大剂量组，配伍组代表千里光配伍组，配药组代表配伍药组。下同。2.3 肝脏指数与正常组比较，各组肝脏指数均无统计学差异（P>0.05）。提示各组药物对小鼠肝脏没有显著的影响。见表2和图2：表2 各组肝脏指数（±S）组别肝脏指数正常组（n=11）0.054 ±0.005千里光小剂量组（n=13）0.057 ±0.006千里光中剂量组（n=13）0.053 ±0.00

11、5千里光大剂量组（n=11）0.058 ±0.004千里光配伍组（n=12）0.053 ±0.008配伍药组（n=12）0.059 ±0.009图2 各组小鼠肝脏指数2.4 肝脏生化指标表3 各组生化指标ALT、AST结果（±S）组别ALT（U/L）AST（U/L）正常组（n=11）16.8 ±4.28.3 ±4.0千里光小剂量组（n=13）9.8 ±3.0*8.9 ±4.7千里光中剂量组（n=13）29.9 ±6.2*6.6 ±4.2千里光大剂量组（n=11）16.6 ±4.310.

12、6±2.5千里光配伍组（n=12）25.5 ±6.8*8.3 ±4.4配伍药组（n=12）19.9 ±7.59.7 ±4.5* 与正常组比较，差异有统计学意义（P<0.05）图3 各组肝脏生化指标ALT结果 图4 各组肝脏生化指标AST结果由上表3及图3、图4可知，ALT中剂量组、小剂量组、配伍组与正常组比较有统计学差异（P<0.05），而AST各组与正常组比较无统计学差异（P>0.05）。但是，与体重和肝脏指数比较，之间没有相关性。提示其差异可能与试剂盒检测操作误差有关。2.5肝脏病理学结果 图5 正常组肝脏（HE 

13、5;400） 图6 千里光小剂量组肝脏（HE ×400） 图7 千里光中剂量组肝脏（HE ×400） 图8 千里光大剂量组肝脏（HE ×400） 图9 千里光配伍组肝脏（HE ×400） 图10 配伍药组肝脏（HE ×400）各组肝脏从肉眼上观察，色泽未见明显变化。组织形态学方面，从病理切片图5图10可知，正常对照组肝细胞形态正常，排列有序，可见单核或双核，肝窦可见肝巨噬细胞；千里光小剂量组、中剂量组肝细胞排列略显疏松和不整，千里光配伍组似乎无明显变化；而千里光大剂量组和配伍药组内，部分个体出现肝细胞排列疏松，体积增大，核仍局中，肝窦结构受压，

14、部分个体尚可。总体而言，千里光大剂量组和配伍药物肝脏无明显的炎性及坏死等病理变化。3分析与讨论3.1 对实验结果的分析关于千里光的毒性，千里光性味苦、寒，归肝、肾二经（1977版中国药典（一部），中药大辞典）。本草拾遗称其：“味苦，平，小毒。”近年来发现，千里光2属中有多种植物都含有肝毒吡咯里西啶类生物碱（Hepatotoxic Pyrrolizidine Alkaloids，PA），对人及家畜肝脏有毒性，可引起肝硬化及蔓延性肝静脉内膜炎，长期使用可导致肝静脉闭塞，出现黄疸和腹水。鉴于文献报道，该药物毒性作用主要在肝脏，因而本实验重点观察肝脏的毒性作用。目前血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和

15、门冬氨酸氨基转移酶（AST）是临床应用最广、诊断效率最高的血清酶3,4。当肝细胞损伤时，肝细胞膜通透性增加，胞浆内的ALT与AST释放入血浆，致使血清ALT与AST的酶活性升高5。故本实验采用ALT和AST作为检测肝功能的生化指标。同步的观察了肝脏的病理和肝脏指数。中药复方配伍是中药的特色，中药复方配伍的目的之一是减毒。研究药物配伍后各药味之间、主要成分之间的相互作用，探讨配伍与毒性的关系，寻找能够有效地制约毒性的配伍条件，对于临床安全用药具有指导意义。故我们选用千里光的常见配伍：菊花、石决明和甘草，主要用于清热解毒，清肝明目。想通过试验观察我国有关千里光的肝损害现象较少是否与千里光的复方配伍

16、有关。关于药物的剂量。本实验大剂量千里光，按小鼠用药为成人公斤体重10倍计，相当于成人用药120克。远远超出了一般成药配伍所采用的剂量，即使临床用药，也很少会用至30克。在如此大的剂量下，未见到明显的毒副作用，提示一些报道的千里光的毒性，可能与其品种有关，而不是本实验采用产自上海地区的品种。对照用复方，在总剂量上，与千里光大剂量相似，以观察可能出现的毒副作用，是否与总用药量有关。实验结果提示，各组体重差异没有统计学意义（P>0.05），肝脏指数差异没有统计学意义（P>0.05），以及生化指标AST差异没有统计学意义（P>0.05）。在生化指标ALT方面，与正常对照组相比，千里光小剂量组ALT下降，千里光中剂量组和千里光配伍组（其中千里光为小剂量用量）ALT升高，其改变不存在与千里光的量效关系；而病理结果显示，千里光大剂量组和配伍药物肝脏出现一定的病理改变，与ALT升高的改变也不存在相关性。因此，综合以上实验结果，考虑到生化指标与病理形态学指标的不一致性，提示这些改变主要系实