两种染色方法在细胞核DNA含量检测中的应用及比较

1、两种染色方法在细胞核DNA含量检测中的应用及比较         08-08-23 16:02:00     编辑：studa20           作者：焦红丽， 冶亚平 夏潮涌    【摘要】  目的 探讨改良、快速两种Feulgen染色方法达到最佳染色效果的水解时间段，为科研和临床的应用提供方法学指导。方法 选取5只成年健康雄性S

2、D大鼠的肝组织，制成肝细胞涂片，分别在室温和60温度下水解不同时间，应用改良和快速两种方法染色，TIGER图像分析仪检测和分析单个肝细胞核的DNA含量。结果 （1） 不同大鼠肝细胞涂片在同一水解温度、时间作用下，相同DNA倍体含量肝细胞的DNA含量大致相同，CV值均小于10%；（2） 二、四、八倍体肝细胞核的DNA含量比值均接近2或4；（3） 同一大鼠相同水解温度不同水解时间，同一倍体的肝细胞核DNA含量存在差异：60水解温度下，IOD(57 min)>IOD(915 min)>IOD(1 min，20 min)，室温水解温度下，IOD(50 min)>IOD(2030 mi

3、n，7090 min)>IOD(51 min，100 min)。结论 HCL水解肝细胞涂片时间过长或过短均不能理想的染色，快速法和改良法Feulgen染色达较佳染色效果的时间段分别为：快速法57 min，改良法2090 min。 【关键词】  DNA分析； 染色与标记方法； Feulgen染色； 肝细胞涂片    Application and comparison of two kinds of staining methods for    Abstract: Objective  To find out

4、 the suitable hydrolysis time for two staining methods of Feulgen and to provide guidline on research and clinic. Methods  Smears of liver cell suspension were obtained from five healthy rats. All the hepatocytes are, respectively, hydrolyzed in different time at room temperature and 60, and th

5、en stained with modified Feulgen stain and quick one. DNA content and ploid of intact hepatocyte nuclei was analyzed by TIGER cell image analysis system. Results  (1) the nuclear DNA contents are almost identical from same DNA content ploidy of different rats under the same temperature and time

6、 of hydrolysis, and the CV of IOD from three types of DNA content ploidy was less than 10 percent. (2) The IOD ratio among diploid, tetraploid and octaploid was close to 2 and 4. (3) The DNA contents of hepatocyte nuclei from same DNA content ploidy of different rats were distinct under the same tem

7、perature and different hydrolysis time: hydrolysis at 60, IOD(57 min)>IOD(915 min)>IOD(1 min，20 min); hydrolysis at room temperature, IOD(50 min)>IOD(2030 min，7090 min)>IOD(510 min，100 min). Conclusion  nuclei DNA cant be stained better for extra long or short hydrolysis time, the b

8、etter hydrolysis time of quick Feulgen stain and modified one are, respectively, 57 min and 2090 min.    Key words: DNA analysis; staining and labeling methods; feulgen staining; smear    细胞核的DNA含量测量与倍体分析对判断肿瘤的良恶性及预后有重要参考价值14。自1924年Feulgen和Rossenbeck5在组织原位上用Feulgen反应显示细

9、胞核的DNA以来，Feulgen反应已广泛应用于生物医学、药学等学科中的细胞、组织化学染色。几十年来，科研工作者们一直从多个角度探索Feulgen反应的最佳反应条件69，以更好地适应不同的应用要求。目前，临床和科研中普遍采用改良Feulgen染色法，该方法相比传统法效果更为稳定，为适应临床上快速染色、诊断的要求，金日男等10改进了染色的过程，提出了快速Feulgen染色法，从而基本满足了临床快速病理诊断的需要。然而，该两种染色方法在具体应用中受到一定的条件限制，同时染色效果也有所差别。本文比较两种染色方法在不同温度、不同时间水解从而寻找改良和快速Feulgen染色法的最适盐酸水解时间，为临床和

10、科研的应用提供参照。    1  材料与方法1.1  制片    正常雄性SD大白鼠五只，水合氯醛麻醉、开腹，生理盐水经门静脉灌注冲洗肝脏，将其游离并切成约0.5  cm×0.5  cm×0.5  cm的组织块，放于筛网中研磨，刮取白色较黏稠的肝细胞悬液，均匀推于另一载玻片上，每只大鼠制片约30张，4%多聚甲醛固定30  min，自然干燥保存。    1.2  快速Feulgen染色   

11、; 5N HCl和Schiffs试剂放入60的恒温箱中预热30  min，每只大鼠取八张涂片，入5N HCl（60）分别水解不同时间（表1）后再放入Schiffs试剂中60恒温染色10  min，自来水冲洗，乙醇脱水封片。    1.3  改良法Feulgen染色     每只大鼠取九张涂片，入5N HCl（室温）分别水解不同时间(表1)后入Schiffs试剂中室温（2328）染色60  min，自来水冲洗，乙醇脱水封片。    1.4  图像分析仪的校正与肝细胞核参数的测量    显微测微台尺（最小刻度10  m）标定TIGER细胞图像分析仪的几何标尺，中国计量科学院出产的标准密度片(DV24,鉴定证书，光字第184041号)标定其光密度值；按柯勒照明要求调整NIKON55i显微镜光源，在物镜(20×NA0.5)与黑白摄像机之间插入535   nm/35 的带通滤光片，按TIGER细胞图像分析仪测量光密度的要求校正系统基准，随机（涂片中部每间隔一视野摄