不同剂量的重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素对糖尿病肾病大鼠肾功能的影响

1、不同剂量的重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素对糖尿病肾病大鼠肾功能的影响    【摘要】  目的 探讨不同剂量的重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素(recombinant adeno-associated virus carrying human angiostatin gene, rAAV-AS)对糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)大鼠肾功能的影响。方法 60只清洁级雄性SD大鼠随机抽取10只作为正常对照组(NC组)，其余造模为糖尿病大鼠。大鼠空腹12 h腹腔注射链尿佐菌素(STZ)60 mg/kg，72 h后尾静

2、脉测血糖大于16.7 mmol/L记为造模成功，适应性喂养1周后，把糖尿病大鼠随机分为DN组(n=10)，rAAV-0组(n=10), AS1组(n=10, 1×1012 VG/kg)，AS2组(n=10, 2×1012 VG/kg)，AS3组(n=10, 4×1012 VG/kg)。AS1组、AS2组和AS3组3组大鼠尾静脉注射rAAV-AS, NC组和DN组分别注射同等剂量的生理盐水，rAAV-0组注射同等剂量rAAV-0空载体;从第2周起，整个实验过程共持续8周。8周后检测各组大鼠的体重(body weight, BW)、肾重(kidney weight,

3、KW)，计算肾指数(kidney index, KI)，检测血糖(blood glucose, BG)、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c, HbA1c)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血肌酐(serum creatinine, SCr)、尿微量白蛋白(miscroalbunminuria, MAU)。结果 与NC组相比，DN、rAAV-0、AS1组的KI、MAU、BUN、SCr、BG、HbA1c明显增高(P<0.05);与DN组相比，AS2组和AS3组KI、MAU、BUN、SCr明显降低(P<0.05);与rAAV-0组相比，AS2组和AS3

4、组KI、MAU、BUN、SCr降低(P<0.05);与AS1组相比，AS2组和AS3组KI、MAU、BUN、SCr降低(P<0.05)。结论 中等剂量和大剂量 rAAV-AS对DN大鼠肾脏具有保护作用，且不依赖血糖降低而起作用。 【关键词】  糖尿病肾病;腺相关病毒载体介导的血管抑素;基因治疗Abstract:Objective To investigate the effect of different doses of recombinant adeno-associated virus carrying human angiostatin gene (rAAV-AS

5、) on the renal function in rats with diabetic nephropathy. Methods 10 out of 60 male SD rats of clean grade were randomly allotted as the normal control group, while the others were used to establish models of diabetic rats. Streptozotocin (STZ) 60 mg/kg was intraperitoneally injected in rats at the

6、 end of 12 h of fasting to induce diabetic model. 72 h later, the blood glucose level of caudal vein was above 16.7 mmol/L, and the diabetic model was marked as successful. After a week of adaptation, diabetic rats were randomized into 5 groups (n=10): group DN, group rAAV-0, group AS1 (1×1012

7、VG/kg), group AS2 (2×1012 VG/kg), group AS3 (4×1012 VG/kg). Different doses of rAAV-AS were injected into groups AS1, AS2 and AS3 from the caudal vein, and the corresponding doses of normal saline were injected in group NC and corresponding doses of rAAV-0 idler injected in group DN. At th

8、e end of the 8th weeks, their body weight (BW) and kidney weight (KW) were measured to calculate kidney index (KI). The blood glucose (BG), glycosylated hemoglobin (HbA1c), miscroalbunminuria (MAU), blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (SCr) were determined.Results Compared with group NC,

9、the levels of KI, BG, HbA1c, MAU, BUN and SCr increased significantly in DN, rAAV-0 and AS1 groups (P<0.05). Compared with group DN, the levels of KI, MAU, BUN and SCr significantly decreased in groups AS2 and AS3 (P<0.05). Compared with group rAAV-0, the levels of KI, MAU, BUN and SCr signifi

10、cantly decreased in groups AS2 and AS3 (P<0.05). Compared with group AS1, the levels of KI, MAU, BUN and SCr significantly decreased in groups AS2 and AS3 (P<0.05).Conclusions rAAV-AS of medium and large doses has protective effect on the kidneys in diabetic rats, independent of the decrease o

11、f blood glucose level.Key words： diabetic nephropathy; recombinant adeno-associated virus carrying human angiostatin gene; gene therapy糖尿病肾病(diabetic nephropathy， DN)是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一,在1型糖尿病中发病率约33%44%,在2型糖尿病中约15%60%,并是造成终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)的重要原因之一。但目前临床应用的药物尚不能有效地逆转DN的进程，因此找到一种可靠的方法

12、预防和治疗糖尿病肾病迫在眉睫。血管抑素(angiostatin, AS)具有抑制血管生成、抗纤维化等生物学学活性，研究表明AS能降低DN的蛋白尿1，但是由于注射AS在体内活性不稳定、表达效率差，因此我们使用不同剂量重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素(recombinant adeno-associated virus carrying human angiostatin gene, rAAV-AS)治疗DN大鼠，观察其对DN大鼠尿微量蛋白和肾功能的影响，以明确不同剂量rAAV-AS对早期DN大鼠的作用。1 材料和方法1.1 实验动物和试剂 雄性SD大鼠，体重160180 g,8周龄，由徐州医学

13、院实验动物中心提供。链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司,rAAV-AS由本元正阳公司构建。1.2 实验分组和模型制备 60只清洁级雄性SD大鼠适应性喂养标准大鼠饲料1周后，从中随机抽取10只作为正常对照组(NC组)，其余造模为糖尿病大鼠。大鼠空腹12 h腹腔注射STZ 60 mg/kg，NC组仅注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72 h后尾静脉测血糖大于16.7 mmol/L记为造模成功，适应性喂养1周后，把糖尿病大鼠随机分为DN组(n=10)，腺相关病毒空载体组(rAAV-0，n=10), rAAV-AS低剂量治疗组(AS1组, n=10, 1×1012 VG/kg)， rAAV

14、-AS中剂量治疗组(AS2组, n=10, 2×1012 VG/kg)，rAAV-AS高剂量治疗组(AS3组, n=10, 4×1012 VG/kg)。rAAV-AS各剂量组大鼠尾静脉注射rAAV-AS, NC组和DN组分别注射同等剂量的生理盐水，rAAV-0组注射同等剂量rAAV-0空载体;从第2周起，整个实验过程共持续8周。1.3 标本收集 各组大鼠于8周末测量体重(BW)，尾静脉取血测定血糖，用代谢笼收集24 h尿液、离心，保存于-40冰箱中，以待测尿白蛋白。大鼠隔夜空腹，1%的戊巴比妥钠(50 mg/kg 腹腔注射)麻醉下心脏采血、离心、取上清，-40冰箱保存，以备

15、测定糖化血红蛋白(HbA1c)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)。然后，取大鼠双肾，除去包膜后测量肾重(KW)，计算肾指数(KI)，公式：KI=KW(g)/BW(kg)。1.4 生化指标检测 胶体金双抗体夹心法检测尿微量白蛋白(MAU)，葡萄糖氧化酶法检测血糖(BG)，分析法检测HbA1c，日立7600 型全自动生化分析仪检测BUN、SCr。1.5 统计学处理 实验数据以±s表示，采用SPSS 13.0统计软件，两组间比较采用t检验，多组间比较采用完全随机设计方差分析法(ANOVA), P<0.05为差异有显著性。2 结 果2.1 一般情况 实验中6只大鼠可能因血糖过高死亡。

16、实验结束时共存活大鼠54只，其中NC组10只， DN组8只，rAAV-0组9只， AS1组10只， AS2组8只, AS3组9只。NC组大鼠精神较好，毛发光泽，体重增加，行动敏捷，食欲好，每天添加1次食物，每周换1次垫料，垫料无异味;DN组大鼠血糖明显升高并出现多饮、多尿、多食、消瘦等典型“三多一少”的糖尿病表现，精神萎靡，毛色晦暗无光泽，体重减轻，行动迟缓，食欲差，易死亡;rAAV-0组和AS1组与DN组大鼠表现类似;AS2组和AS3组大鼠精神一般，毛发无明显晦暗，体重增加，行动可，食欲好，每2天添加1次食物，每周换2次垫料。2.2 各组大鼠KI变化情况 与NC组相比，DN、rAAV-0、A

17、S1组KI明显增高(P<0.05);与DN组比较，AS2、AS3组KI降低(P<0.05);与rAAV-0组比较，AS2、AS3组KI降低(P<0.05);与AS1组比较，AS2、AS3组KI降低(P<0.05)。见表1。表1 rAAV-AS对各组大鼠KI的影响与NC组比较：*P<0.05;与DN组比较：#P<0.05;与rAAV-0组比较：P<0.05;与AS1组比较：+P<0.052.3 各组大鼠生化指标的影响 与NC组比，DN、rAAV-0、AS1、AS2、AS3组BG、HbA1c、MAU、BUN、SCr明显增高(P<0.05);与D

18、N组相比，AS2、AS3组MAU、BUN、SCr明显降低(P<0.05);与rAAV-0组相比，AS2、AS3组MAU、BUN、SCr明显降低(P<0.05);与AS1组相比，AS2、AS3组MAU、BUN、SCr明显降低(P<0.05)。见表2。表2 rAAV-AS对各组大鼠的生化指标的影响与NC组比较：*P<0.05;与DN组比较：#P<0.05;与rAAV-0组比较：P<0.05;与AS1组比较：+P<0.053 讨 论DN病理学特征性改变表现为肾脏肥大、肾小球和肾小管基底膜增厚、细胞外基质积聚致系膜区扩张，最后导致肾小球纤维化、硬化2。临床表现

19、为微量白蛋白尿、肾功能不全等。本实验结果显示，与NC组比，DN、rAAV-0、AS1组KI、BG、HbA1c、MAU、BUN、SCr明显增高(P<0.05)，说明此模型已出现DN典型改变;与DN组相比，AS2、AS3组KI、MAU、BUN、SCr明显降低(P<0.05)，治疗后DN大鼠MAU、BUN和SCr有明显改善，提示中剂量和大剂量rAAV-AS对DN大鼠的肾脏具有保护作用，并且增加剂量并不能出现更好的效果，而且这种改善不依赖于血糖降低。AS最初是OReilly等3于1994年从Lewis肺癌小鼠血清和尿液中分离出的能够特异性抑制肿瘤血管内皮细胞增生的因子,是大分子物质纤溶酶原

20、的一个片段，目前国内外研究AS对DN的作用很少。AS基因注射宿主，转染效率低、安全性差而且费用高昂， AAV是一种无包膜的人单链DNA病毒,重组AAV由于其宿主范围广，免疫原性低,表达携带基因长久等优点而越来越多地被用于基因治疗的实验研究4-5。本实验使用rAAV-AS注射到DN大鼠体内，6周后，大鼠MAU、BUN、SCr明显降低，提示其对糖尿病大鼠肾脏有保护作用，可能机制与血管抑素能明显阻止肾小球系膜中高糖和 TGF-诱导的 MCP-1、I CAM-1分泌,抑制 DN的炎症反应和血管抑素可能是肾脏中 TGF-1和 VEGF的内源性拮抗剂或抑制剂有关1。综上所述，中剂量和大剂量rAAV-AS对

21、DN早期起保护作用，且这种作用并不依赖于血糖水平的降低。rAAV-AS对DN的保护作用的具体机制我们将在今后的实验中继续探讨。【参考文献】  1 Zhang SX, Wang JJ, Lu K, et al. Therapeutic potential of angiostatin in diabetic nephropathy J. J Am Soc Nephrol, 2006, 17(2):475-486.2 Dronavalli S, Duka I, Bakris GL. The pathogenesis of diabetic nephropathy J. Nat Clin Pract Endocrinol Metab