三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞内钙离子浓度的作用

1、三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞内钙离子浓度的作用        【摘要】  目的：观察三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞内钙离子浓度的作用。 方法：体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞，分别以400 g/mL和800 g/mL PNS处理细胞，在激光共聚焦显微镜下观察细胞内钙离子浓度的变化。 结果：随着给药浓度的增加，和空白对照组相比，各给药组的细胞内钙离子浓度均有所下降(P<0.05)，两给药组之间差异也具有统计学意义(P<0.05)。 结论：三七总甙能够抑制人增生性瘢痕成纤维细胞内钙离子浓度，并

2、具有剂量依赖效应。 【关键词】  瘢痕;成纤维细胞;三七总甙;钙离子ABSTRACT Objective: To observe the effect of the panax notoginseng saponins(PNS) on the intracellular free calcium contentration in human hypertrophic scar fibroblasts in vitro. Methods: The hypertrophic scar fibroblasts were cultured in vitro and treated with

3、PNS (400 and 800 g/mL concentration). The intracellular free calcium concentration was investgated by confocal lasermicroscopy. Results: Compared with the control group, the intracellular free calcium concentration was inhibited significantly after PNS treatment(P<0.05), and there was significant

4、 difference between the two PNS treated groups(P<0.05). Conclusion: The PNS can inhibit the intracellular free calcium concentration in human hypertrophic scar fibroblasts with the dosedependent manner.KEY WORDS Scar; Fibroblast; Panaxnotogin seng; Free calcium增生性瘢痕(hypertrophic scar, HS)是临床上常见的皮

5、肤纤维化疾病之一，瘢痕的异常增生和挛缩常常导致患者外观畸形和功能障碍，目前仍未发现满意的预防和方法。药用三七是五加科人参属多年生草本植物三七的根，三七总甙(panax notogin seng， PNS)是三七的有效成分，具有防治肝、肾及肺部纤维化疾病的作用1，近年来对于三七总甙作用于人增生性瘢痕的研究工作也取得一定的进展2。成纤维细胞内的Ca2+浓度，与细胞增殖、细胞外基质合成及降解有着密切的关系。本实验通过观察三七总甙作用于体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibroblast, HSF)后，细胞内Ca2 +浓度变化情况，以进一步探讨三七总甙抑制人增生性瘢

6、痕的作用机制。1 材料和方法1.1 实验材料三七总甙粉剂购置于云南金泰得制药总公司。培养液为 DMEM(美国HYCLONE公司)，医用净化工作台(苏州净化设备公司YJ875型)，二氧化碳培养箱(美国SHELLAB1815TC型)，倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂XSJD型)，Olympus光学显微镜，激光扫描共聚焦显微镜(德国)。1.2 实验方法1.3 统计学处理实验所有计量数据用平均数和标准差(±s)来表示，并采用SPSS10.0统计软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，比较组间差异;两两比较用Turkey方法，P<0.05为统计学差异显著，P>0.05为无统计学差

7、异。2 结果2.1 倒置相差显微镜下观察细胞形态人增生性瘢痕成纤维细胞在倒置显微镜下观察呈典型长梭形，胞体较大，部分细胞可见向外伸出23个长短不一的突起，胞体的两极细长，细胞走向趋于一致，依靠紧密且排列整齐，为典型的成纤维细胞。加入三七总甙处理后，随着药物浓度增大、作用时间延长，活细胞数量逐渐减少，细胞间隔增宽。细胞突起明显缩短，呈多角型，甚或消失。细胞变圆，胞体缩小。细胞质减少，有的呈空泡状，染色质浓缩边聚，胞核模糊或断裂成块状，见图1、2。2.2 三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞内钙离子浓度的作用不同浓度三七总甙处理人增生性瘢痕成纤维细胞后细胞内Ca2+荧光强度均呈现增强幅度下降的态势，但

8、持续时间和幅度有所不同，见图3、4。和空白对照组相比较，400 g/mL组细胞内Ca2+荧光强度在5 min之内下降幅度为29%，而800 g/mL组在5 min内下降幅度为48%，在随后约10 min的观察期内，这种钙荧光水平没有明显下降的趋势，相对稳定于一个平台期，通过数据分析，3组的变化率分别达到0.66%、29.11%、48.26%，见图5。经统计学分析，与空白对照组相比较，两给药组均具有显著性差异(P<0.05)，两给药组之间也具有显著性差异(P<0.05)。以上结果表明，随着PNS浓度的增加，Ca2+下降时间段在延长，而Ca2+荧光强度的峰值也随之而降低。1  

9、;       3 讨论器官纤维化的基本病理过程包括成纤维细胞过度增殖、异常凋亡以及细胞外基质过量沉积。这一过程改变了组织器官原有的正常结构，引起其功能的相应改变。成纤维细胞是创伤愈合、瘢痕形成以及器官纤维化过程中的功能细胞。其胞质膜上存在Ca2+、Na+等多种离子通道。正常生理机制钙离子通道对细胞内游离Ca2+浓度的调控有一定的限度，在生理状态下，一般胞浆内Ca2+浓度约为10-4 mol/L，而细胞外Ca2+浓度约为0.11 mol/L左右，两者相差34个数量级。钙离子通道的状态直接影响到细胞内游离钙离子的浓度，而细胞内

10、游离钙浓度的升降对细胞的增殖起着决定性的作用3。细胞内Ca2+浓度增高是很多疾病发生的病理生理基础。如果能够找到通过改变Ca2+通道活性而影响成纤维细胞增殖及其细胞外基质合成、分泌与降解的药物，对于临床上创伤、瘢痕增生以及器官纤维化具有重大意义。三七总甙为传统中药材五加科人参属植物三七的有效成分，其块根中含皂甙约为12%。三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖具有抑制作用，400 g/mL三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞有明显的抑制作用，使得细胞增殖曲线偏离S型形态，800 g/mL三七总甙给药组中，细胞的增殖曲线为一条明显的下滑线，人增生性瘢痕成纤维细胞的数量明显减少，表明这种抑制作用具有剂量

11、依赖效应4。已有研究表明，三七总甙是Ca2+通道阻滞剂5，但其对人增生性瘢痕成纤维细胞中Ca2+是否存在抑制作用，尚未见报道。本实验用不同浓度的三七总甙作用于人增生性瘢痕成纤维细胞，观察到如下结果：选用荧光探针Fluo3/AM 观测细胞荧光强度，以反映三七总甙作用于人增生性瘢痕成纤维细胞中Ca2+浓度的变化，发现大约在PNS作用1 min后，空白对照组成纤维细胞内Ca2+的荧光强度几乎没有改变，而增生性瘢痕成纤维细胞内Ca2+的荧光强度逐渐下降，400 g/mL给药组下降幅度达到了29%，而800 g/mL给药组荧光强度在5 min之内下降了48%。这表明三七总甙可以抑制增生性瘢痕成纤维细胞内

12、Ca2+浓度，并且具有剂量效应。结合前述三七总甙具有抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖的作用4，我们推测三七总甙有可能通过降低细胞内Ca2+浓度来抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖， 其机制仍需进一步研究。【】  1 刘剑毅, 姚恒, 戴霞, 等. 三七总甙抗纤维化作用的研究进展J.美容医学,2006，15(8):985986.2 姚恒, 李世荣, 刘剑毅, 等. 三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞转分化的作用J.中华烧伤杂志,2007,23(3):188190.3 Fiorio Pla A, Maric D, Brazer SC, et al. Canonical transient receptor potential1 plays a role in basic fibroblast growth factor (bFGF)/FGF receptor1 induced Ca2+ entry and embryonic rat neural stem cell proliferationJ. The Jour