不同病理类型肾病综合征患者尿蛋白对人肾小管上皮细胞凋亡的影响 - 图文-

1、·论著·不同病理类型肾病综合征患者尿蛋白对人肾小管上皮细胞凋亡的影响吴丽丹,冯胜军,卓华钦,张莞灵,刘华锋作者单位:523326广东省东莞市,南方医科大学附属东莞市石龙人民医院肾内科(吴丽丹,卓华钦,张莞灵;广东医学院基础医学院微生物与免疫学教研室(冯胜军;广东医学院附属医院肾病研究所(刘华锋【摘要】 目的 探讨不同病理类型肾病综合征患者尿蛋白对人肾小管上皮细胞(hrTESc 凋亡的影响。方法提取人类微小病变肾病综合征、膜性肾病综合征、局灶-节段性肾病综合征患者尿蛋白,进行蛋白成分分析、细菌内毒素试验、蛋白溶液的肌酐水平等质量鉴定后,试验组分别按1、2、4、8g /L 尿蛋

2、白浓度刺激hrTECs 48h ,空白组无尿蛋白,Hoechst 33258染色法观察hrTECs 凋亡情况。结果 尿蛋白组分构成:微小病变肾病综合征清蛋白83.8、转铁蛋白11.9、IgG 3.4;膜性肾病综合征清蛋白56.4、转铁蛋白34.6、IgG 6.9;局灶-节段性肾病综合征清蛋白59.9、转铁蛋白15.3、IgG 13.8。尿蛋白浓度1、2、4、8g /L 时,膜性肾病综合征组较微小病变肾病综合征组细胞凋亡率均升高(P 0.05吴丽丹,冯胜军,卓华钦,等.不同病理类型肾病综合征患者尿蛋白对人肾小管上皮细胞凋亡的影响J .中国Effects of Proteinuria on Apo

3、ptosis of Human Renal Tubular Epithelial Cells in Patients with Different Pathological Types of Renal Syndrome WU Li -dan ,FENG Sheng -jun ,ZHUO Hua -qin ,et al.Department of Nephrology ,Southern Medical University Affiliated Dongguan Shilong People's Hospital ,Dongguan 523326,China【Abstract 】 O

4、bjective To explore the effects of proteinuria on the apoptosis of human renal interstitial cells in patientswith different pathological types of renal syndrome.Methods Urinary protein was extracted from patients with minimal change disease (MCD ,membranous nephropathy (MN and focal -segmental renal

5、 synthesis (FSGS .The protein composition a-nalysis ,bacterial endotoxin test and protein creatinine level test were conducted.The urinary protein with concentration of 1,2,4and 8g /L respectively were used to stimulate human renal tubular epithelial cells (hrTECs for 48h ,and the control groupbe th

6、e most crucial pathogenic factor.【Key words 】 Proteinuria ;Nephrotic syndrone ;Apoptosis ;Epithelial cells许多研究证实尿蛋白在慢性肾脏疾病的进展中发挥了非常重要的作用。尿蛋白的主要作用是能够活化肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cell,rTEC,使其分泌各种生物活性因子,在肾间质中激活成纤维细胞和趋化炎性细胞,参与肾间质纤维化。而肾间质纤维化是多种肾脏疾病发展到终末期的共同途径。肾间质纤维化与细胞增殖、凋亡的动态平衡密切相关1-2。但是,尿蛋白的性质(清蛋

7、白、转铁蛋白、IgG、40100kD血清蛋白等和严重程度在肾小管间质病变进展中的作用仍有很大分歧。此外,不论是体外还是动物模型中,总是存在一些问题,如大多数研究仅使用一种或两种蛋白,或者使用正常血清清蛋白而非患者的血清蛋白对肾小管细胞损伤进行研究。此外,不同病理类型肾病综合征患者的尿蛋白能否直接导致rTEC凋亡及其差异性,尚无肯定报道。因此,本实验选取临床上常见的人类不同肾病综合征患者(微小病变肾病综合征、膜性肾病综合征、局灶-节段性肾病综合征的完整尿蛋白刺激人肾小管来源的rTEC,分析其凋亡情况,旨在为尿蛋白对人肾小管-间质纤维化的机制提供重要依据,为延缓慢性肾衰竭的进展寻找治疗新途径。1

8、材料与方法1.2 细胞培养从液氮罐中取出冷冻hrTECs,3740水中快速复溶,加适量含10胎牛血清的DMEM/ F12培养液(含0.03L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100g/ml链霉素,置于培养箱内培养,培养条件为37、5CO2。0.125胰蛋白酶(Trysin-0.02乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2消化传代。1.3 尿蛋白的提取与质量分析选取广东医学院附属医院肾内科已经临床确诊的原发性肾病综合征患者(微小病变肾病综合征、膜性肾病综合征、局灶-节段性肾病综合征的尿蛋白,且无感染并发症,尚未应用激素及任何免疫抑制剂,肾活检病理类型分别为微小病变、膜性肾病和局灶-节段性肾病综合征。收

9、集入选患者清洁中、后段尿,冷冻离心,饱和硫酸铵沉淀尿蛋白。PEG20000浓缩。超滤灭菌。蛋白浓度定量。-70保存备用。挑取一小部分蛋白溶液行蛋白质量验证。蛋白电泳:做该标本来源尿液的蛋白电泳,旨在排除尿蛋白在提取过程中是否发生成分变化;细菌内毒素试验:旨在确保蛋白没受细菌污染;蛋白溶液的肌酐水平:旨在看蛋白是否还混有尿液。1.4 Hoechst33258染色法观察细胞凋亡hrTECs培养于6孔板中,载玻片爬片,无血清细胞培养液孵育24 h,使细胞同步于静止期,弃上清液,加含尿蛋白培养液,每种病理类型尿蛋白浓度分别为0、1、2、4、8g/ L,孵育细胞48h;3:1的甲醇:冰醋酸液4固定5 m

10、in,5mg/L的Hoechst33258避光染色5min。选用340 nm的激发光观察:在荧光显微镜下,活细胞呈弥散均匀荧光,凋亡细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞。计算每孔5个高倍(400视野平均细胞总数、凋亡细胞数和细胞凋亡百分率。空白组设置为无尿蛋白的培养液刺激hrTECs。1.5 统计学方法使用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量资料以(xs表示,多组比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA,两两比较用方差齐性检验(levene检验,当总体方差齐时,选择Bonferroni 法;当方差不齐时,选择Tamh

11、ane's T2法。以P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 细胞形态和表面结构相差显微镜下可见正常的hrTECs为多角形鹅卵石样排列,胞体扁平,细胞紧密衔接,融合成单层(见图1 。图1 正常DMEM/F12培养基培养的hrTECs(200Figure1 hrTECs cultured on normal DMEM/F12medium 2.2 抽提尿蛋白的质量及分析结果每种病理类型选择3例患者,分别抽提出患者的尿蛋白,蛋白溶液的肌酐水平为0.381mol/L,均低于人体参考范围的下限(参考范围44133mol/L,鲎实验确定细菌内毒素试验检测值为0.008EU/ml,亦低于人体参

12、考范围的下限(0.1EU/ml。尿蛋白电泳示各病理类型肾病综合征患者尿蛋白成分相同,主要为清蛋白、转铁蛋白、IgG。微小病变肾病综合征清蛋白83.8、转铁蛋白11.9、IgG3.4;膜性肾病综合征清蛋白56.4、转铁蛋白34.6、IgG6.9;局灶-节段性肾病综合征清蛋白59.9、转铁蛋白15.3、IgG13.8(见图2 。图2 不同病理类型肾病综合征患者尿蛋白的电泳分析Figure2 Electrophoretic analysis of urine proteins from patients with three types of nephrotic syndrome2.3 肾病综合征患

13、者尿蛋白对细胞凋亡的影响尿蛋白浓度1、2、4、8g/L时,膜性肾病综合征组较微小病变肾病综合征组细胞凋亡率均升高,差异有统计学意义(P0.05;局灶-节段性肾病综合征组较膜性肾病综合征组和微小病变肾病综合征组细胞凋亡率均升高,差异有统计学意义(P0.05。3组尿蛋白浓度1、2、4、8g/L时较空白时,2、4、8g/L时较1g/L时,4、8g/ L时较2g/L时,8g/L时较4g/L时细胞凋亡率均升高,差异有统计学意义(P0.05,见表1。3 讨论肾功能的进展主要取决于肾间质损伤的严重程度。研究表明,尿蛋白可作为独立的致病因子,直接造成肾小管间质损害3-4。对多种人类和动物模型研究提示尿蛋白是参

14、与损伤和加速肾功能恶化的重要因素5。其中,rTEC增殖凋亡参与了肾间质纤维化的发生,推测rTEC的过度凋亡可能是肾小管萎缩的原因,并参与了肾间质纤维化的发生机制。在多种肾脏疾病的动物模型(如单侧输尿管结扎模型、5/6肾切除模型、高血压肾硬化模型、慢性环孢霉素肾病模型、嘌呤霉素氨基核苷慢性肾病模型等6-8以及人体多种肾脏疾病病理标本中发现,间质纤维化越重的地方,rTEC凋亡数量越多,间质纤维化程度与细胞凋亡数量呈正相关9。但是,成分复杂的尿蛋白中哪种蛋白成分在疾病的发展过程中具有致病作用,迄今尚无定论。许多研究表明清蛋白导致肾小管间质损伤。该机制包括上皮细胞-成肌纤维细胞的转分化,细胞因子以及炎

15、性因子单核细胞趋化蛋白1(MCP-1、转化生长因子(TGF-等的分泌、细胞外基质(ECM的聚积、平滑肌蛋白SM22-表达等10-13。不过这些研究使用了大剂量的纯化人血清清蛋白或者牛血清清蛋白,或许无法真实模拟尿中清蛋白的作用。另外许多研究表明某些尿蛋白也许不是肾小管间质损伤的始动因素。Morais等14发现低分子量蛋白不会影响hrTECs的凋亡,而高分子量蛋白则影响hrTECs的凋亡。并且转铁蛋白也可以通过hrTECs上调C3的合成,而不是清蛋白15。因此,真实地分析肾病患者的尿蛋白成分、比例以及与肾间质纤维化的关系,有助于进一步了解肾间质纤维化发生发展的分子机制。本实验首先采集尿蛋白,并进

16、行质量分析(尿蛋白内的细菌内毒素对细胞凋亡带来毒性已经排除,肌酐检测可以排除尿液成分残留,提供了实验数据的可靠性;为了更加明确在肾间质损伤中尿蛋白的主要毒性成分,因此对尿蛋白的组分差异性进行分析,通过蛋白电泳提示不同病理类型肾病综合征患者的尿蛋白成分相同,主要为清蛋白(大部分、转铁蛋白、IgG。其中,微小病变肾病综合征清蛋白83.8、转铁蛋白11.9、IgG 3.4;膜性肾病综合征清蛋白56.4、转铁蛋白34.6、IgG6.9;局灶-节段性肾病综合征清蛋白59.9、转铁蛋白15.3、IgG13.8。采用体外实验,表1 不同病理类型肾病综合征细胞凋亡率比较(xs,n3Table1 Compari

17、son of apoptosis rate of hrTECs among different pathological types of nephrotic syndrome组别尿蛋白浓度(g/L空白 1 2 4 8 F值P值注:与微小病变肾病综合征组比较,*P0.05;与膜性肾病综合征组比较,P0.05;与尿蛋白浓度空白比较,P0.05;与尿蛋白浓度1 g/L比较,P0.05;与尿蛋白浓度2g/L比较,P0.05;与尿蛋白浓度4g/L比较,P0.05选取人近端hrTECs株,采用上述人类不同病理类型肾病综合征患者的完整尿蛋白刺激hrTECs,发现同一病理来源的尿蛋白的浓度与hrTECs凋亡

18、增加存在剂量依赖关系,即细胞凋亡数量愈多,由于该类蛋白组合源于患者自身的蛋白,尤其是其中的清蛋白占了大多数,导致hrTECs的凋亡或许与该类蛋白相关,也旁证了大剂量的纯化人血清清蛋白或者牛血清清蛋白导致的肾小管间质损伤。此外,局灶-节段性肾病综合征患者的尿蛋白作用最强,膜性肾病综合征次之,微小病变肾病综合征最弱,根据3类病理类型的尿蛋白的组成可以发现, IgG的组分含量由多至少分别为局灶-节段性肾病综合征、膜性肾病综合征、微小病变肾病综合征。Bazzi 等16-17研究证实局灶-节段性肾病综合征患者尿IgG 占总蛋白的比例与节段性肾小球硬化有相关性。由此,可以推测,尿中存在的IgG可能是尿蛋白

19、对肾小管毒性作用的重要因素,尿IgG的排出可能是肾病进展的标志之一。由此,可能提示在尿蛋白引起的肾脏纤维化进展中,尿清蛋白可能不是最重要的毒性成分。尿蛋白其他成分如脂蛋白、转铁蛋白和补体与肾小管间质损害的关系有待下一步的有关研究证实。众所周知,细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程,是机体清除非机体所需细胞、维持自身细胞稳定性的一种特殊的细胞死亡方式,也是清除异常增殖细胞的一种重要途径。以上分析表明,hrTECs的异常凋亡与尿蛋白存在必然关系,尤其是尿中IgG成分的存在和含量的多少,与hrTECs的凋亡具有重要的因果关系和剂量关系,大量肾小管细胞凋亡,使肾小管局部环境破坏,这可能是触发间质细胞过度增

20、殖,并最终形成纤维化的重要因素。本研究结果可能为深入阐明肾间质纤维化提供重要的实验依据,最终将为延缓慢性肾衰竭的进展寻找治疗新途径。参考文献1 刘华锋,姚翠微,皇甫长梅,等.白细胞介素18对促进肾小管萎缩和间质纤维化的影响J.中国中西医结合肾病杂志,2004,5(12:690-693.2 黄凌虹,张国强,叶任高,等.细胞增殖与凋亡在单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化发病中的意义J.中华肾脏病杂志,2000, 16(1:24-27.3 Keane WF.Proteinuria:its clinical importance and role in progressive re-nal disease

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