EB病毒检测工作技术应用进展与临床应用

1、EB病毒检测工作技术应用进展与临床应用概述概述Epstein-BarrEpstein-Barr病毒（病毒（EBVEBV）p 疱疹病毒科，疱疹病毒科，亚科，嗜淋巴细胞病毒属，亚科，嗜淋巴细胞病毒属，p 1964Epstein1964Epstein、BarrBarr等人首次在非洲儿童的恶性淋巴瘤组织培养中发现。等人首次在非洲儿童的恶性淋巴瘤组织培养中发现。p EBVEBV是是传染性单核细胞增多症的病原体，也是一种重要的肿瘤相关病毒，是是传染性单核细胞增多症的病原体，也是一种重要的肿瘤相关病毒，与鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌、移植后淋巴增殖症等多种肿瘤的发生密切相关，与鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌、移植后淋巴增殖症

2、等多种肿瘤的发生密切相关，被列为致癌性病毒之一。被列为致癌性病毒之一。概述概述 传播途径：传播途径：EBVEBV感染主要通过唾液接触传播，也可通过血液传播；感染主要通过唾液接触传播，也可通过血液传播； 人感染人感染EBVEBV后建立终身潜伏感染，人群感染率超过后建立终身潜伏感染，人群感染率超过90%90%。1-61-6岁儿童、岁儿童、14-2014-20岁青少年及年轻成年人高度易感，发展中岁青少年及年轻成年人高度易感，发展中国家国家EBVEBV感染多发生在儿童早期。感染多发生在儿童早期。病原学病原学p疱疹病毒科，疱疹病毒科，疱疹病毒亚科，淋巴隐病疱疹病毒亚科，淋巴隐病毒属，人疱疹病毒毒属，人疱

3、疹病毒4 4型型p球形双链球形双链DNADNA病毒，基因组平均大小约为病毒，基因组平均大小约为172 kb172 kbEBV致病机制致病机制 原发原发EBV感染时，感染时，EBV先是在口咽部上皮细胞内增殖，然后感先是在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染附近的染附近的B淋巴细胞，受到感染的淋巴细胞，受到感染的B淋巴细胞进入血液循环可以淋巴细胞进入血液循环可以造成全身性感染。造成全身性感染。 EBV原发感染后，大多数无临床症状，尤其是原发感染后，大多数无临床症状，尤其是6岁以下幼儿岁以下幼儿大多表现为隐性或轻型发病，但在儿童期、青春期和青年期大多表现为隐性或轻型发病，但在儿童期、青春期和青年期 ，约，

4、约50%的原发性感染均表现为的原发性感染均表现为IM。 EBV在人体在人体B细胞建立潜伏感染，细胞建立潜伏感染，EBV只表达潜伏抗原（包括只表达潜伏抗原（包括EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-LP、LMP-1、LMP-2及及EBER），受感染者将成为终身带毒者。），受感染者将成为终身带毒者。 在机体免疫功能下降和某些因素触发下，潜伏的在机体免疫功能下降和某些因素触发下，潜伏的EBV可以被再可以被再激活，引起病毒复制及临床疾病。激活，引起病毒复制及临床疾病。EBV致病机制致病机制EBV常见相关疾病常见相关疾病 传染性单核细胞增多症传染性单核细胞

5、增多症 （Infectious mononucleosis,IM)Infectious mononucleosis,IM) 慢性活动性慢性活动性EBEB病毒感染病毒感染 （Chronic active EBVinfectionChronic active EBVinfection，CAEBVCAEBV） EBEB病毒相关性嗜血细胞综合征病毒相关性嗜血细胞综合征 （EBV-associated hemophagocytic syndrome, EBVAHS)EBV-associated hemophagocytic syndrome, EBVAHS) BurkittsBurkitts淋巴瘤淋巴瘤

6、 何奇金淋巴瘤何奇金淋巴瘤EBVEBV感染的抗原表达感染的抗原表达是是EBVEBV的中和性抗原的中和性抗原EBVEBV感染的抗原表达感染的抗原表达原发性原发性EBVEBV感染过程中首先产生针对衣壳感染过程中首先产生针对衣壳抗原（抗原（capsid antigen, VCAcapsid antigen, VCA）IgGIgG和和IgMIgM，在急性感染的晚期，抗早期抗原（在急性感染的晚期，抗早期抗原（early early antigen, EAantigen, EA）抗体出现在恢复期晚期，抗核）抗体出现在恢复期晚期，抗核抗原（抗原（nuclear antigen, NAnuclear anti

7、gen, NA）抗体产生，）抗体产生，抗抗VCA-IgGVCA-IgG和抗和抗NA-IgGNA-IgG可持续终身可持续终身EBV感染的血清学诊断传统检测策略的问题5%新近新近EBV感染不出现感染不出现CA-IgM抗体抗体在罕见的病例中抗CA-IgM会持续存在约20-30%的新近感染不出现EA-IgG抗体抗EBNA-IgG抗体可能呈现阴性，由于：- 慢性活动性EBV感染- 细胞免疫被抑制EBVEBV感染的血清学诊断感染的血清学诊断p抗抗VCA-IgMVCA-IgM和和IgGIgG可以同时出现，通常可以同时出现，通常IgGIgG出出现较现较IgMIgM晚，但偶尔较晚，但偶尔较IgMIgM出现早出现

8、早1 12 2周，抗周，抗VCA-IgMVCA-IgM几周后检测不到几周后检测不到p抗抗EA-IgGEA-IgG在发病后在发病后3-43-4周后升高，周后升高，3 34 4月后月后检测不到检测不到p抗抗EBNA-1-IgGEBNA-1-IgG在发病后在发病后3 34 4周被检测到，周被检测到，持续终身，部分慢性持续终身，部分慢性EBVEBV感染者检测不到感染者检测不到p抗抗VCA-IgGVCA-IgG和抗和抗EBNA-1-IgGEBNA-1-IgG终生持续阳性终生持续阳性EBV常见相关疾病常见相关疾病传染性单核细胞增多症传染性单核细胞增多症(IM)(IM)infectious mononucl

9、eosis 特指由特指由EBV感染引起的发热、咽炎和淋巴结肿大的综合征感染引起的发热、咽炎和淋巴结肿大的综合征 1889年被首次描述为年被首次描述为“glandular fever” 1920年正式定义为年正式定义为IM 1932年发现嗜异性凝集实验年发现嗜异性凝集实验 1968年实验室工作人员感染年实验室工作人员感染EBV，出现，出现IM临床症状和嗜异性凝集抗临床症状和嗜异性凝集抗体，明确体，明确EBV是是IM的病原的病原IMIM临床表现临床表现p25-30%25-30%的青少年和的青少年和3010102.52.5copies/g copies/g n原位杂交：检测出原位杂交：检测出EBER

10、-1EBER-1阳性细胞阳性细胞nSouthernSouthern杂交：受累组织或外周血中检测出杂交：受累组织或外周血中检测出EBV DNAEBV DNAn免疫荧光：检测到抗原（免疫荧光：检测到抗原（EBNAEBNA、LMPLMP）n感染的感染的B B、T T、NKNK细胞、单核细胞、单核/ /巨噬巨噬/ /组织细胞检测到组织细胞检测到EBNAEBNA、EBEREBER、EBV-DNAEBV-DNAEBVEBV相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症EBV-associated hemophagocytic lymphohistocytosis EBV-HLH p

11、是一种与是一种与EBVEBV感染有关的淋巴增殖伴随吞噬血细胞现象的一类疾病感染有关的淋巴增殖伴随吞噬血细胞现象的一类疾病p EBVEBV感染所致感染所致CD8+TCD8+T细胞的异常增殖及其激活巨噬细胞，导致炎症细胞因子大量释放细胞的异常增殖及其激活巨噬细胞，导致炎症细胞因子大量释放产生高细胞因子血症（细胞因子风暴）是产生高细胞因子血症（细胞因子风暴）是EBV-HLHEBV-HLH的主要病例生理特征的主要病例生理特征p临床表现发热、肝脾肿大、黄疸、全血细胞减少、临床表现发热、肝脾肿大、黄疸、全血细胞减少、DICDIC，骨髓和其他组织见嗜血细胞、，骨髓和其他组织见嗜血细胞、LDHLDH、铁蛋白、

12、铁蛋白、微球蛋白微球蛋白pEBV-HLHEBV-HLH常见于儿童和青少年常见于儿童和青少年抗抗EBVEBV病毒药物病毒药物p 无环核苷拟似剂无环核苷拟似剂n acyclovir（阿昔洛韦），（阿昔洛韦），ED50 0.3n ganciclovir（更昔洛韦），（更昔洛韦）， ED50 0.05n valaciclovir（缬昔洛韦（缬昔洛韦 ）p 无环核苷酸无环核苷酸n cidofovir，adefovirp 焦磷酸盐焦磷酸盐 拟似剂拟似剂 n foscarnet（磷甲酸钠）（磷甲酸钠）p作用机制作用机制n 作用病毒作用病毒DNA多聚酶，抑制病毒复制多聚酶，抑制病毒复制EBVEBV感染的实验室

13、诊断感染的实验室诊断p 外周血分类外周血分类n 淋巴细胞淋巴细胞50% WBC50% WBCn 不典型淋巴细胞不典型淋巴细胞10% WBC10% WBC（系激活的（系激活的CD8+ CTLCD8+ CTL）p 血清学检查血清学检查n 嗜异性凝集实验（嗜异性凝集实验（heterophile test/spot testheterophile test/spot test）n VCA-IgMVCA-IgM、IgGIgG，EA-IgGEA-IgG，EBNA-IgGEBNA-IgGp 病毒学标志病毒学标志n 在在PBMCPBMC、血清、全血或感染组织检测、血清、全血或感染组织检测EBV-DNAEBV-

14、DNA、EBEREBER、EBNAEBNA、LMPLMPEBVEBV感染疾病的血清学诊断感染疾病的血清学诊断诊断诊断VCA IgMVCA IgMVCA IgGVCA IgGEA IgGEA IgGEBNA IgGEBNA IgG既往无感染既往无感染IM (IM (急性期急性期) )IMIM（恢复期）（恢复期）/ / / /既往感染既往感染低低/ /慢性活动性感染慢性活动性感染/ /高高高高/ /临床需要回答的问题临床需要回答的问题 是否感染是否感染EBV?EBV? EBVEBV感染的时相？感染的时相？ 是否是否EBVEBV活动性感染？活动性感染？ 疾病是否与疾病是否与EBVEBV感染相关？感染

15、相关？EBV实验室检测方法实验室检测方法 病毒培养病毒培养 免疫学技术（免疫荧光法，免疫组化技术）免疫学技术（免疫荧光法，免疫组化技术） 血清学方法（血清学方法（ELISA法，化学发光法）法，化学发光法） 基因诊断技术基因诊断技术 嗜异凝集抗体试验：也称嗜异凝集抗体试验：也称“Monospot”试验。在试验。在EBV还未确定为还未确定为IM的病因之前，的病因之前，1932年引入临床实践诊断年引入临床实践诊断IM。当时发现当时发现IM患者的血清或血浆可以凝集马或绵羊的红细胞。该抗体在患者的血清或血浆可以凝集马或绵羊的红细胞。该抗体在病程第病程第12周出现，持续约周出现，持续约6个月。个月。在青少

16、年原发性在青少年原发性EBV感染中其阳性率可达感染中其阳性率可达80-90，约，约10的青少年的青少年缺乏对嗜异性抗体的阳性反应。缺乏对嗜异性抗体的阳性反应。EBV实验室检测方法实验室检测方法EBVEBV感染的血清学诊断评价感染的血清学诊断评价p 嗜异性抗体（嗜异性抗体（heterophile antibody，HA）凝集实验（）凝集实验（“spot” test）n 嗜异性抗体（嗜异性抗体（IgM）在发病后）在发病后7天内出现，天内出现，2-5周达高峰，可以持续周达高峰，可以持续6-12个月，偶有个月，偶有12个月后以低水平存在个月后以低水平存在n HA阳性提示原发急性感染，阳性提示原发急性感

17、染，EBV再激活感染几乎阴性再激活感染几乎阴性n 阳性率：青少年和成年人阳性率：青少年和成年人71%-90%， 2-5岁儿童岁儿童50%n 假阴性：发病第假阴性：发病第1周内假阴性率周内假阴性率25%，10%成人始终阴性成人始终阴性n 假阳性：假阳性：2-3%自身免疫性疾病、自身免疫性疾病、HIV感染、心内膜炎、感染、心内膜炎、HAV肝炎肝炎v缺点缺点需要硬件设备需要硬件设备成本昂贵成本昂贵v优点优点敏感性高敏感性高特异性强特异性强操作简便操作简便化学发光技术化学发光技术胶体金是氯金酸HAuCl4的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态简便

18、，快捷，敏感度和特异度较差EBERSEBERS原位杂交试验原位杂交试验 EBV EBV潜伏感染的细胞含有大量的潜伏感染的细胞含有大量的EBERlEBERlEBER2EBER2（EBERSEBERS）转录子，其主要功能是抑制干扰素介导的抗病毒效应和凋亡转录子，其主要功能是抑制干扰素介导的抗病毒效应和凋亡。该转录子不翻译成蛋白质，每个。该转录子不翻译成蛋白质，每个EBVEBV潜伏感染的细胞含有大潜伏感染的细胞含有大约约10106 6拷贝拷贝EBERSEBERS，被认为，被认为EBVEBV潜伏感染的最好标志物，因此原位杂交潜伏感染的最好标志物，因此原位杂交检测肿瘤细胞中检测肿瘤细胞中EBERSEBE

19、RS是诊断肿瘤是否是诊断肿瘤是否EBVEBV相关的金标准相关的金标准EBV实验室检测方法实验室检测方法EBV病毒核酸检测病毒核酸检测 实时荧光定量实时荧光定量PCR是目前最主要的监测是目前最主要的监测EBV载量的方载量的方法法 鉴别鉴别EBV健康携带者的低水平复制与健康携带者的低水平复制与EBV相关疾病患相关疾病患者高水平活动性感染。者高水平活动性感染。 EBV EBV载量检测有多种方法，载量检测有多种方法，Real-time PCRReal-time PCR是目前最是目前最主要的监测主要的监测EBVEBV载量的方法，有较强的敏感性和特异载量的方法，有较强的敏感性和特异性。不同的性。不同的EB

20、VEBV疾病进行疾病进行Real-time PCRReal-time PCR检测时，需要的检测时，需要的标本不同。标本不同。EBV病毒核酸检测病毒核酸检测疾病疾病感染细胞感染细胞感染方式感染方式检测病毒定量的最合适标本检测病毒定量的最合适标本血浆血浆/ /血清血清单核细胞单核细胞全血全血传染性单核传染性单核细胞增多症细胞增多症（IMIM）B B细胞细胞浆细胞浆细胞溶解性感染溶解性感染潜伏潜伏理想理想不推荐不推荐不推荐不推荐移植后淋巴移植后淋巴增殖性疾病增殖性疾病（PTLDPTLD）B B细胞细胞潜伏潜伏理想理想最合适最合适慢性活动性慢性活动性EBVEBV感染感染（CAEBVCAEBV）T T细

21、胞细胞NKNK细胞细胞潜伏潜伏评价预后评价预后适合诊断适合诊断EBV相关性疾病的病毒相关性疾病的病毒DNA定量检测定量检测血清游离的血清游离的EBV-DNA提示原发感染或者再激活提示原发感染或者再激活健康携带者血清健康携带者血清EBV-DNA通常检测不到通常检测不到传单的传单的EBV感染实验室诊断感染实验室诊断血清学检测：血清学检测：p同时满足下列同时满足下列2条者可以诊断为条者可以诊断为EBV-IM:p1.下列临床症状中的下列临床症状中的3项：发热、咽峡炎、颈淋巴结肿大、肝肿大、脾肿大；项：发热、咽峡炎、颈淋巴结肿大、肝肿大、脾肿大；p2.原发性原发性EBV感染的血清学证据，满足下列感染的血

22、清学证据，满足下列2条中任一项：条中任一项： （1）抗）抗EBV-CA-IgM和抗和抗EBV-CA-IgG阳性，且抗阳性，且抗EBV-NA-IgG阴性阴性（2）抗）抗EBV-CA-IgM阴性，但抗阴性，但抗EBV-CA-IgG阳性，且为低亲和力抗体阳性，且为低亲和力抗体传单的传单的EBV感染实验室诊断感染实验室诊断DNA检测？检测？:p IM患者外周血中患者外周血中EB病毒载体在病毒载体在2周内达到峰值，随后很快下降。周内达到峰值，随后很快下降。p 至病程至病程14天，多数天，多数EBV-IM患者血清中已检测不到病毒核酸，患者血清中已检测不到病毒核酸，病程病程22天后，所有天后，所有EBV-IM患者血清中均检测不到病毒核酸。患者血清中均检测不到病毒核酸。p IM患者不推荐进行患者不推荐进行EB病毒载量检测病毒载量检测慢性活动性慢性活动性EBV感染的实验室诊断感染的实验室诊断p EBV抗体检测抗体检测抗体反应抗体反应类型类型EBV抗体抗体比例（比例（%）CA-IgGCA-IgMEA-IgGNA-IgG1+-+54.92+-+