反向微胶团萃取与双水相萃取

1、反向微胶团萃取与双水相萃取一、反相微胶团萃取的概念 由于在水溶液中加入表面活性剂而形成的胶体结构中，表面活性剂的活性基团（即亲水性部分）朝外，即靠向水溶液，而非极性基团（即疏水性部分）则靠内而互相聚集成一种结构。 上述情况发生在以极性液体（大多数情况下是水）作为溶剂的情况下。 如果溶剂为非极性液体，当加入活性剂至一定浓度时，由于表面活性剂的极性和非极性基团的定向排列，也会形成微胶团结构。但是这种结构与上述结构相反，表面活性剂的非极性基团部分朝外，即朝向非极性溶剂部分，而极性基团部分则朝内，因而形成一种与水相微胶团结构反相的聚集体，这种聚集体就称为反相微胶团。 在反相微胶团中，表面活性剂的极性基

2、团部分围成一个极性核心，称为水池。这个水池包括表面活性剂的极性基团内表面和其中的水分，以及溶解于水中的离子等。具有亲水性的大分子就可以溶解于水池中的水分而被以微胶团的形式萃取出来。 将待分离组分以微胶团形式进行萃取的过程，称为微胶团萃取或胶团萃取，如待分离组分是以反相微胶团的形式被萃取，就称为反相微胶团萃取。二、反相微胶团萃取的原理 在反相微胶团萃取过程中，蛋白质或酶等生物大分子主要以水壳的形式存在于反相微胶团中的极性核心部分，能避免与有机溶剂直接接触，因而可以尽量的保持整个萃取过程中生物大分子活性不丧失，这样，既能溶出酶和蛋白质等生物大分子，又能与水相分离，并尽可能的保存了这些生物大分子的生

3、物活性。 关于蛋白质被反相微胶团的萃取机理有三种见解：（1）在反相微胶团中，由表面活性剂的极性部分围成一个中心，中心为水等极性溶剂占有，生物大分子就溶解其中，并且在生物大分子周围包膜着一层水壳，对生物大分子起保护作用。即所谓的水壳模型。此种说法最有说服力。（2）认为生物大分子虽然溶解于表面活性剂极性部分围成的中心，但在中心部分生物大分子是以被吸附的状态附着于胶团的极性壁上。（3）认为生物大分子的非极性部分与多个微胶团的非极性部分连接，由此形成生物大分子溶解于多个微胶团之间的一种状态。 反相微胶团的形成、大小及形状，与表面活性剂的种类、浓度以及操作时的温度、压力等有关。反相微胶团一般比水相微胶团

4、要小，其分子聚集数一般都小于50。而水相微胶团的分子聚集数在50100之间。反相微胶团中的水分含量通常用非极性溶剂中的水浓度和表面活性剂之比0来表示： 0H2O/表面活性剂0值越大，反相微胶团内的水分含量就越多，形成的反相微胶团的半径就越大。能溶解水溶性成分的量就越多。因此， 0值大小可以反应出反相微胶团的大小和溶解能力。1、表面活性剂和溶剂的种类表面活性剂在溶剂中的浓度必须达到一定值，否则就不能形成微胶团，这个形成微胶团所必须的最低浓度叫做表面活性剂形成微胶团的临界浓度（CMC）。 不同表面活性剂的CMC值在0.11mmol/L之间，随温度、压力、溶剂的变化而变化。最常用:表面活性剂-丁二酸

5、二异辛酯磺酸钠 （Aerosol OT，简称AOT）， 溶剂-异辛烷（2，2，4三甲基戊烷）。AOT能溶解在有机溶剂中，也能溶解在水中，形成反相微胶团。AOT在形成反相微胶团时的0值较大，可达60。2、水相酸碱度 微胶团内水分的酸碱度主要影响到生物大分子的荷电性，进而影响到生物大分子和反相微胶团的结合。 AOT属于阴离子型表面活性剂，其亲水部分带负电荷，形成的反相微胶团内表面带负电。当反相微胶团内水相的pH值小于生物大分子的等电点pI时，可使生物大分子带正电，这样生物大分子可与反相微胶团中带负电性的内表面相吸，形成比较稳定的含生物大分子的反相微胶团，可以较容易的进行萃取。3、水相中的离子强度

6、反相微胶团中水相离子强度对反相微胶团萃取的影响可以用盐溶和盐析现象来解释。在低离子强度下，酶和蛋白质等生物大分子表面上的荷电性和亲水性得到了改善，溶解度上升，与反相微胶团的内表面的结合能力增强。当水相中的离子强度升高到一定程度时，由于抵消了生物大分子表面上的电荷，并且由于离子的水化作用而使蛋白质分子表面上的水膜消失，减少了与反相微胶团的内表面的结合作用，从而降低了溶解度，使分离效率降低。4、 0值的大小0值的大小也直接影响到反相微胶团的萃取效率。0值太小，说明反相微胶团内的水分含量不高，对生物大分子的溶解度下降，甚至当0值过小时，形成的反相微胶团太小，生物大分子根本无法进入反相微胶团内，这样就

7、必然影响到萃取效率。反相微胶团的分离过程分两步：第一步：含生物大分子的反相微胶团的形成第二步：反相微胶团的破乳及生物大分子的释放。形成含生物大分子的反相微胶团的方法有多种，最常用到的有3种：1、相转移法 通过含生物大分子的水相与溶解有表面活性剂的有机相接触，缓慢的搅拌，在形成反相微胶团的同时，其中的生物大分子就转移到反相微胶团中，直到处于萃取的平衡状态为止。2、注入法 通过将含有生物大分子的水溶液注入到含有表面活性剂的有机相中，从而实现萃取过程。3、溶解法 对固体粉末中含有的生物大分子，或不溶于水的生物大分子，可采用溶解法进行。其过程是先制备好含水（0330左右）的反相微胶团的有机溶液，然后把

8、含生物大分子的固体粉末加入此中反相微胶团的有机溶液中，同时搅拌，生物大分子慢慢地即可进入到反相微胶团内的水中心而实现萃取过程。 生物大分子的释放： 可参考液膜分离的方法，将混合液送入到澄清器中，使反相微胶团与外相有机溶剂分离。然后对溶解有生物大分子的反相微胶团进行破乳以释放其中的生物大分子，破乳的原理和方法有化学破乳和物理破乳等，可以参考液膜分离技术。 以溶菌酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的萃取为例说明影响萃取效果的因素1、水相pH值对蛋白质萃取的影响 水相的pH值对蛋白质的萃取影响较大。溶菌酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的萃取率在pH9时，接近100，随着pH值的增大，萃取率下降，并在其 等电点时（pI11

9、.1）附近急剧下降，直至萃取率接近零。2、盐浓度对蛋白质萃取率的影响该影响主要来自两方面：（1）离子强度增大时，反相微胶团内表面的双电层变薄，使蛋白质表面与反相微胶团表面之间的静电引力下降；（2）反相微胶团的内表面的双电层变薄后，也减小了表面活性剂极性头之间的斥力，使反相微胶团变小。反相微胶团的大小正比于含水量0。3、蛋白质相对分子量对萃取的影响 当蛋白质分相对子量大于30000时，最大萃取率小于60，效果明显下降，因此如何使反相微胶团变得足够大，使其能包住蛋白质，是反相微胶团萃取中有待解决的一个重要课题。4、阳离子种类对萃取率的影响 阳离子种类对萃取率的影响主要体现在改变反相微胶团内表面的电

10、荷密度上。通常反相微胶团中表面活性剂的极性部分不会是完全电离的，有很大一部分阳离子仍在胶团的内表面上。极性部位的电离程度愈大，反相微胶团内表面的电荷密度越大，产生的反相微胶团也愈大。一、概述 双水相萃取技术是60年代以来研究开发的新型分离技术，已广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物工程等领生物化学、细胞生物学和生物工程等领域，实现了生物产品的分离和纯化。90年代以来，采用双水相萃取技术提取分离生物小分子的研究已有报道。1、概念 双水相系统双水相系统是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解，形成的互不相溶的两水相或多水相系统。 通过溶质在相间的分配系数的差异，进行组分分离或多

11、水相提取的技术即为双水相萃取双水相萃取。 混合物的不溶性最初是由贝杰林克（Beijerinck）通过把（明胶琼脂）溶液与（明胶可溶性淀粉）溶液相混合时发现的。之后发现这是一种普遍现象，把多种不相溶的聚合物溶液混合在一起，可以得到多相体系，最多的有时达18个相。双水相体系组成聚合物-聚合物-水聚丙烯乙二醇-聚乙二醇甲氧基聚乙二醇-聚乙烯醇聚乙二醇-葡萄糖聚乙烯吡咯烷酮-甲基纤维素钠高分子电解质-聚合物-水硫酸盐葡聚糖钠盐-聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖钠盐-甲基纤维素高分子电解质-高分子电解质-水硫酸盐葡聚糖钠盐-羧基甲基纤维素钠盐硫酸盐葡聚糖钠盐-羧基甲基葡聚糖钠盐聚合物-低分子组分-水聚丙烯乙二

12、醇-磷酸钾甲氧基聚乙二醇-磷酸钾聚乙二醇-磷酸钾聚丙烯乙二醇-葡萄糖 双水相技术具有较高的选择性和专一性，该技术简单、方便且不存在有机溶剂残留等问题，因此有广阔的应用前景。 双水相萃取也存在着某些缺点制约着其大规模应用和发展，例如某些高聚物的价格高，常常需要高浓度的盐才能进行有效的分离，因此难以应用于无法使用高盐浓度的亲和分离过程。2.原理在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即系线双节线 在系线上各点处系统的总浓度不同，系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时，即在图b的双节

13、线上c点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，因此c点称为临界点a双节线系线均相区两相区临界点b双节线均相区两相区系线临界点3 .优点： 双水相萃取之所以受到重视主要是由于对生化分离具有明显的优点： (1)易于放大，各种参数可以按比例放大40000倍以上，而产物收率并不降低，这是其他过程无法比拟的，这一点对于工业应用尤为有利；(2)由于双水相系统之间的传质过程和平衡过程快速，因此相对于某些分离过程来说，能耗较小，而且可以实现快速分离。聚合物可以重复使，成本低。(3)易于进行连续化操作，例如可以采用高分配系数和选择性的多级逆流分配。 (4)由于双水相的相间张力大大低于有机溶剂与水相之

14、间的相间张力，相分离过程温和，使生化分子如酶不易受到破坏，而且可以直接在双水相系统中进行生物转化以消除产物抑制； (5)由于双水相系统受影响的因素复杂，从某种意义上说可以采取多种手段来提高选择性或提高收率；(6)整个操作过程可以在室温下进行，操作条件温和。 双水相萃取在分离细胞碎片和胞内蛋白质的过程中显示出极大的优越性和发展潜力： （1）大多数情况下目标产物的回收率高于90； （2）目标产物的分配系数多在120范围，一般都大于3； （3）大量杂质蛋白能够与所有固体物质一起被去掉，与其他常用固液分离方法相比，双水相萃取可省去一到两个过程。二、影响组分在双水相系统中分配的主要因子1.聚合物的相对分

15、子质量 聚合物的相对分子质量增加，生物大分子或颗粒在该聚合物在该相中的分配系数会下降。2.成相溶液的浓度 当成相溶液浓度接近临界点时，可溶性组分会均匀的分配在两相中，当远离临界点时则趋向一侧分配。3、无机盐对于带负电荷的蛋白质，其分配系数因阳离子的存在按下列顺续降低Li+NH4+Na+Cs+K+一价阴离子则按下列顺序降低： F-Cl-Br-I-所以为了增加带负电的蛋白质的分配系数应使用Li+、HPO42-、SO42-和2价柠檬酸根离子等，降低分配系数则用KCI、和NaCl。4、 pH值 pH值对组分的影响较为复杂。5、温度 温度的变化可以改变相的组成，温度升高时，两相中蛋白质的分布趋于一致，增加聚合物的浓度，可