复习重组DNA技术应用

1、复习重组DNA技术应用v重组重组DNA技术（技术（基因工程技术基因工程技术） 在体外对不同来源的在体外对不同来源的DNA分子经重新组合形分子经重新组合形成重组体，并导入宿主细胞建立无性繁殖体系成重组体，并导入宿主细胞建立无性繁殖体系的过程。的过程。v又称：DNA克隆，分子克隆，或基因工程基因工程。基本概念基本概念vDNA重组：重组： 不同来源的不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合成新的而重新组合成新的DNA分子的过程。分子的过程。v克隆：克隆： 指由一个细胞经过无性繁殖形成子代群体的指由一个细胞经过无性繁殖形成子代群体的过程。过程。第一节第一节 工具酶工具

2、酶限制性内切酶限制性内切酶DNA聚合酶聚合酶DNA连接酶连接酶工具酶工具酶逆转录酶逆转录酶碱性磷酸酶等碱性磷酸酶等第一节第一节 工具酶工具酶v 限制性内切酶概念：限制性内切酶概念： 一类能够有选择的识别双链一类能够有选择的识别双链DNA分子中的分子中的特定核苷酸序列，并在识别位点及其周围切割双特定核苷酸序列，并在识别位点及其周围切割双链链DNA中磷酸二酯键的核酸内切酶。中磷酸二酯键的核酸内切酶。 简称限制酶，大多从细菌中发现。简称限制酶，大多从细菌中发现。第一节第一节 工具酶工具酶（一）分类（一）分类 限制性内切酶分为三种类型限制性内切酶分为三种类型 I、 型型 ：不常用：不常用 型：具有高度

3、特异性的型：具有高度特异性的DNA裂解点，裂解点， 是基因工程中最重要的工具酶。是基因工程中最重要的工具酶。CTTAAGGCAATT例：例：EcoRI 酶切位点酶切位点限制性内切酶（限制性内切酶（ restriction endonuleasesrestriction endonuleases ）：从特殊）：从特殊的酶切位点将的酶切位点将DNADNA分子切开分子切开 5，G AATTC 3， 3，CTTAA G 5， 切口类型：切口类型：例：Hpa I 5，GTT AAC 3， 3，CAA TTG 5，平末端平末端:粘末端粘末端3，突出末端突出末端:5，突出末端突出末端:例：EcoR I 5，

4、G AATTC 3， 3，CTTAA G 5， 例：Pst I5，CTGCA G 3，3，G ACGTC 5，粘性末端：错开突出的单链粘性末端：错开突出的单链末端，很容易与互补的末端，很容易与互补的单链单链末端末端 配对粘合起来，因此称为粘性末端配对粘合起来，因此称为粘性末端 。限制性内切酶限制性内切酶第一节第一节 工具酶工具酶vDNA连接酶连接酶 连接酶（连接酶（ ligase ligase ）：能够催化双链）：能够催化双链DNADNA分子中相邻的分子中相邻的3 3- -OHOH和和5 5- -P P末端之间形成磷酸二酯键末端之间形成磷酸二酯键, ,使使DNADNA分子连分子连接起来的酶接起

5、来的酶. . 例如：例如： T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶第一节第一节 工具酶工具酶逆转录酶（逆转录酶（reverse transcriptasereverse transcriptase） 末端转移酶末端转移酶TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶 其他工具酶其他工具酶 用于通过用于通过PCRPCR对对DNADNA分子的特定序列进行体外合成扩增分子的特定序列进行体外合成扩增第二节第二节 重组重组DNA常用载体常用载体v载体载体 是携带目的是携带目的DNA片断进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具，片断进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具，本质是一段核苷酸序列。本质是

6、一段核苷酸序列。 载体的条件载体的条件 1. 自我复制能力 2. 具有多个酶切位点，供外源基因插入 3. 具有合适的筛选标志 4. 分子量不宜过大 第二节第二节 DNA重组载体重组载体v常用的载体有质粒、噬菌体和病毒载体等。v按用途有克隆载体、表达载体一、质粒载体 细菌染色体外具有自我复制能力的双链环状细菌染色体外具有自我复制能力的双链环状DNA分子。分子。质粒载体条件质粒载体条件1.具有松弛型复制子具有松弛型复制子2.存在数个限制性酶切位点，存在数个限制性酶切位点，便于目的便于目的DNA插入插入3.具有筛选标志具有筛选标志4.分子量相对较小分子量相对较小复制起始复制起始点点AMP抗性抗性pB

7、R3224363bpTet抗性抗性第三节第三节 重组重组DNA的基本步骤的基本步骤v重组重组DNA的基本过程的基本过程 一、目的基因的制备 二、载体的选择与构建 三、目的基因与载体的连接 四、重组DNA导入宿主细胞 五、重组DNA的筛选与鉴定 六、外源基因的表达、分离与纯化第三节第三节 DNA重组与鉴定重组与鉴定一、目的一、目的DNA片断的制备片断的制备来源：1 基因组基因组DNA (genomic DNA )2 cDNA (complementary DNA) 制备制备cDNA3人工合成人工合成DNA片段片段 人干扰素、胰岛素、脑啡肽、血管紧张素、胸腺素人干扰素、胰岛素、脑啡肽、血管紧张素、

8、胸腺素等等4PCR或逆转录酶或逆转录酶PCR扩增特定的扩增特定的 DNA片段或片段或cDNAv二、载体的选择与构建 根据实验目的，选择合适的载体 质粒质粒 噬菌体噬菌体三、目的DNA片断与载体的连接 粘性末端连接法粘性末端连接法 平末端连接法 同聚体加尾连接法 人工合成接头连接法粘性末端连接效率高于平粘性末端连接效率高于平末端。末端。粘性末端连接载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目的基因目的基因平末端连接平末端连接 同聚体加尾连接同聚体加尾连接 人工合成接头连接人工合成接头连接四、重组DN

9、A导入宿主细胞v 宿主细胞：宿主细胞： 原核细胞（大肠杆菌） 真核细胞(哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞)v 方式：转化、转染、感染方式：转化、转染、感染等v 方法：方法： 物理法：电穿孔，显微注射法 化学法：CaCl2法，磷酸钙法 生物法：脂质体法 三、重组三、重组DNADNA分子导入宿主细胞分子导入宿主细胞转化-重组DNA分子导入原核细胞转染-重组DNA分子直接导入真核细胞感染-使用噬菌体或病毒将重组DNA分子导入细胞方式：方式：转化、转染、感染五、重组五、重组DNA的筛选与鉴定的筛选与鉴定 （一）根据载体的遗传性状进行筛选（一）根据载体的遗传性状进行筛选 （二）根据重组（二）根据重组DNA

10、的结构特征进行筛选的结构特征进行筛选（一）根据载体的遗传学性状进行筛选（一）根据载体的遗传学性状进行筛选 1. 抗生素抗性标志筛选抗生素抗性标志筛选 2. 抗性标志插入失活筛选抗性标志插入失活筛选3. -半乳糖苷酶显色反应筛选半乳糖苷酶显色反应筛选切接转增检 lacZ基因基因(编码编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶) X-gal X + gal (半乳糖半乳糖) (兰色兰色) X-gal: 5-bromo - 4 - chloro -3-indolyl -galactoside5溴溴- 4氯氯- 3吲哚吲哚 - -半乳糖半乳糖 (无色无色) 兰色兰色兰色无色无色噬菌斑（噬菌斑（plaques）：）：

11、重组重组 兰色噬菌斑兰色噬菌斑 未重组未重组 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 常用的方法常用的方法: : 凝胶电泳凝胶电泳 限制性内切酶图谱限制性内切酶图谱 PCRPCR扩增扩增 核酸分子杂交核酸分子杂交 DNADNA序列分析序列分析（二）根据重组DNA的分子生物学特征进行鉴定v电泳、酶切分析：初步鉴定电泳、酶切分析：初步鉴定vPCRPCR扩增、分子杂交：比较明确的鉴定扩增、分子杂交：比较明确的鉴定v序列测定：最终鉴定序列测定：最终鉴定 （ 四）重组子的筛选与鉴定载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNADNA cDNAcDNA人工合成人工合成PCRPCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNADNA目的基因目的基因连接连接重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染重组体进入宿主重组体进入宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交重组重组DNADNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤外源基因的表达外源基因的表达表达产物蛋白质