心肌型脂肪酸结合蛋白胶体金检测试纸条的制备和初步应用.docx

1、,论著.心肌型脂肪酸结合蛋白胶体金检测试纸条的制备和初步应用彭林峰，罗广，席仲兴，袁皓加，张正雷，潘宪云，路东，金红燕，陈国怀(兰州生物制品研究所有限责任公司甘市省疫苗工程技术研究中心，兰州730046)摘要：目的应用胶体金免疫层析法制备检测全血或血清样本中心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的检测试纸条，用于急性心肌梗塞(AMI)的早期辅助诊断。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，标记鼠抗心肌型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，喷于玻璃纤维膜上制成胶体金结合物垫，将另一株鼠抗心肌型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和抗鼠二抗分别包被检测线和质控线，组装成试纸条进行灵敏性、特异性、精密性、稳定性及临床样品检测。

2、结果该试纸条的检测灵敏度为10ng/mL,15min内可判定结果；与肌钙蛋白I、C反应蛋白、肌酸激酶、人心肌肌红蛋白无交叉反应。检测240份临床标本，与临床诊断结果进行配对分析，阳性符合率95.83%、阴性符合率100%、总符合率97.92%。结论制备的H-FABP检测试纸条有良好的灵敏性、特异性，可用于早期AMI的辅助诊断、关键词:心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP);急性心肌梗塞(AMI)；胶体金免疫层析中图分类号：R392-33文献标志码：A文章编号：10055673(2013)06-0035-05Preparationandpreliminaryuseofagoldimmuno-chr

3、omatographyassaytodetecttheH-FABPPENGLin-feng,LUOGuang,XIZhong-xing,YUANHao-jia,ZHANGZheng-lei,PANXian-yun,LUDong,JINHong-yan,CHENGuo-huai(LcuizhouInsliluteofBiologicalProductsCo.,Ltd.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Ijanzhou730046,China)Abstract：ObjectiveTodevelopthedetectionkito

4、fhumanheart-typefattyacidbindingprotein(H-FABP)fromthewholebloodorserumsamplesusingcolloidalgoldimmunochromatographytechnology,fortheearlydiagnosisofacutemyocardialinfarction(AMI).MethodsThecolloidalgoldwasobtainedbytrisodiumcitratereductionmethod.Colloidalgoldparticleslabelledwithmonoclonalantibody

5、ofH-FABPwereusedasthedetectorreagentandcoatedonsomeglassfiberanddried.TheothermonoclonalantibodyofH-FABPandpurifiedanti-mouseIgGwereblottedonthetestlineandcontrolregionsofnitrocellulosemembrane.Thenthestripwasfinishedandthedetectionsensitivity,specificity,precision,stabilityweremeasured,andclinicals

6、amplesweredoneaswell.ResultsThedetectionsensitivityofthismethodwas10ng/mLandtheanalysisprocesscanbecompletedwithin15min.TherearenocrossreactionswithcardiactroponinI,C-reactiveproteinjhumancreatinekinaseMBandmyocardialmyoglobin.Tocomparelheagreementofpositivity/negativitybetweenclinicalsamplesandresu

7、ltswith240cases,wefoundthatthepositivecoincidencerateis95.83%andnegativecoincidencerateis100%,andthetotalcompliancerateis97.92%.ConclusionsTheteststripfortherapiddetectionofH-FABPhavebeenmadewithgoodsensitivityandspecificity,canbeusedforearlydiagnosisofAMI.Keywords：Humanheart-typefattyacidbindingpro

8、tein(H-FABP);Acutemyocardialinfarction(AMI);Colloidalgoldimmunochromatographytechnology急性心肌梗死(Acutemyocardialinfarction,收稿日期：2OI3-O7-Q5;修回日期：2013-10-10作者简介:彭林峰(1975-)，男，医学生物学工程师，主要从事诊断试削生产和研发。通信作者：席仲兴,E-mail:xiyue8342181AMI)发生后迅速明确诊断、尽早治疗是降低死亡率、改善预后的关键。AMI早期生化标志物是诊断的必要指标，其中的心肌型脂肪酸结合蛋白(Hearttypefatty

9、acidbindingprotein,H-FABP)是心肌细胞胞浆中的小分子蛋白质，相对分子质量约1500011o健康人血液中心肌型脂肪酸结合蛋白含量极低，当心肌细胞受损时，心肌型脂肪酸结合蛋白可从心肌细胞迅速释放进入血液中。近年来研究发现，心肌型脂肪酸结合蛋白在AMI发生1.5h后出现在血浆中,6h达到高峰,随后逐渐下降，到24h后恢复到正常水平。而且,H-FABP对早期AMI的诊断敏感性显著高于cTnl（肌钙蛋白I）和CK-MB（肌酸激酶同工酶），其诊断发病3h内的AMI亦明显优于cTnl.CK-MB和MYO,表明H-FABP可作为早期急性心肌梗死更适宜的检测指标*句。研究制备的H-FAB

10、P检测试纸条，为急性心肌梗塞的诊断提供一种快速、简便的方法，有良好的临床应用价值。1材料和方法1.1材料1.1.1试剂、活性材料及耗材氯金酸、柠檬酸三钠、牛血清白蛋白购自SIGMA公司；硝酸纤维素膜、聚酯膜、全血滤膜、吸水滤纸购自Millipore公司；PVC胶板购自上海金标生物科技有限公司；H-FABP、兔抗鼠IgG多克隆抗体、抗H-FABP单克隆抗体7C8和2G4由兰州生物制品研究所有限责任公司诊断用品室制备并经过鉴定C1.1.2主要仪器设备CM4000型切条系统、XYZ3O5O型喷点系统购自美国BIODOT公司,RC-6PLUS型超速离心机购自美国ThemoFisher公司，Milli-

11、QUFPLUS型超纯水器购自美国Millipore公司，EF4型爱德华冷冻干燥机购自英国EdwardsHighVacuum公司，加热磁力搅拌器购自德国IKA公司,TLM810DSPC型紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司。1.2方法1.2.1胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法制备，有研究表明"粒径在1070nm的胶体金最大吸收峰与粒径之间存在线性关系：丫=0.4271X+514.56（式中丫为最大吸收峰,X为胶体金粒径）。用量筒量取500mL去离子水加至1000mL三角烧瓶中，用磁力搅拌器加热系统搅拌加热至沸腾。取1%柠檬酸三钠溶液8.75mL加入三角烧瓶中，继续搅拌加热

12、煮沸，在搅拌下快速准确加入1%氯金酸溶液5.0mL,继续搅拌煮沸10min后，停止加热。紫外可见分光光度计用去离子水校零，取3.0mL冷却至2224龙的胶体金溶液，在波长400700nm范围进行连续光谱扫描，测胶体金溶液的最大吸收蜂波长，由上述回归方程计算胶体金粒径。1.2.2胶体金最佳标记蛋白量及最佳标记pH的确定将抗H-FABP单抗7C8用0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液稀释至5.0mg/mLo将制备好的胶体金溶液分装11管，每管1-0mL。将待标记抗体按110piL的量分别加入对应的上述各管中，混匀。对照管中不加抗体。5min后，在上述各管中加入0.1mL10%NaCl溶液，混匀后

13、静置5min,观察结果O将制备好的胶体金溶液分装8管，每管1.0mLc用0.1mol/L的碳酸钾缓冲液分别调节pH至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5,加入足量单抗7C8,混匀。5min后，在上述各管中加入0.1mL10%NaCl溶液，混匀后静置5min,观察结果。1.2.3胶体金标记物的制备按前述试验确定好的最佳标记蛋白量及最佳标记pH进行标记，将抗H-FABP单抗7C8逐滴加入胶体金溶液中，于28乞振荡4h后加入牛血清白蛋白（BSA）,其终浓度为1%,继续振荡30min。标记好的胶体金结合物溶液于2000r/min、28乞离心30min,弃沉淀。上清8000r/

14、min、28T离心30min后弃上清，沉淀用原体积含1%BSA的0.01mol/LpH7.4的磷酸缓冲液重悬后，8000r/min、28T离心30min后弃上清，沉淀用适量胶体金标记物重悬液重悬，测胶体金标记物溶液的最大吸收峰波长，然后用重悬液将胶体金标记物稀释至该波长处的4值为2.0。1.2.4H-FABP参考品的制备用5%牛血清溶液稀释基因工程表达的H-FABP,含量分别为80、40、20、10、5、0ng/mL制成灵敏度参考品；用10份无传染性疾病、无心脏病史、无肾脏病史、无糖尿病的健康人血浆制成阴性参考品;用4份临床确诊为AMI并且用ELISA定量试剂盒检测H-FABP含量分别为50.

15、4、37.9.28.6.17.7ng/mL的血清制成阳性参考品；用5%牛血清溶液稀释基因工程表达的H-FABP,含量为20ng/mL,制成精密性参考品。1.2.5硝酸纤维素膜的包被抗H-FABP单抗2G4及兔抗鼠IgG多克隆抗体用0.01mol/LPH7.4的磷酸缓冲液均稀释至2.0mg/mLo稀释好的抗体用0.22pjn的一次性滤器过滤后，用BIODOT喷点系统包被在硝酸纤维素膜上，包被批为1讶/cm,2224弋、相对湿度10%干燥1224ho干燥后的硝酸纤维素膜放在装有硅胶的干燥皿中2224T保存。1.2.6H-FABP快速检测试纸条的组装将硝酸纤维素膜、金结合垫、滤血膜、样品垫、吸水垫依

16、次贴在PVC胶板上，用CM4000型切条系统按照5mm/条的宽度进行切割后装入塑料外壳中,装袋,加入干燥剂封口后于230T保存备用。1.2.7H-FABP检测试纸条性能验证特异性:将C反应蛋白、人肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶、人心肌肌红蛋白用5%牛血清溶液稀释至不同浓度，各取100皿滴加到试纸条的样品垫上，15min内观察结果;灵敏性：用H-FABP质量浓度分别为80、40、20、10、5、0ng/mL的灵敏度参考品检测试纸条，设立阴性对照和空白对照，在15min时观察T线颜色变化，确定T线出现红色条带时的参考品浓度；稳定性：制备的试纸条放置于3638幻，分别于第3、6、9、15、21天，用参考

17、品检测其性能;将试纸条放置于2224T,分别于第1、4、8、12、16、20月，用参考品检测其性能;精密性:将两批试纸条用精密性参考品重复检测20次，观察在同一浓度下,每条试纸T线的颜色变化。1.2.8临床样本检测阳性样本为中国人民解放军总医院和中国人民解放军第305医院住院及门诊就诊的AMI患者共120例的血清,入选标准为所有患者均经临床表现、心电图动态演变和心肌生化标志物检查确诊。阴性样本为中国人民解放军总医院和中国人民解放军第305医院门诊健康体检者的血清，入选标准为：血脂、血压、血糖、肝肾功能以及心电图均正常，排除外伤、肌肉病变、心血管疾病、糖尿病和其他内分泌疾病共120例。应用H-F

18、ABP快速检测试纸条检测120份临床阳性样本、120份临床阴性样本，与临床诊断结果进行配对分析，计算阳性符合率、阴性符合率、总符合率。阳性符合率=4/(4+B)xl00%,阴性符合率=D/(C+D)xl00%，总符合率=(4+D)/(4+fi+C+D)xlOO%,见表1。表1试纸条检测结果与临床诊断结果Tab.1ConformitybetweenH-FABPkitandclinicaldiagnosisresults试纸条检测结果合计阳性阴性阳性AB临床诊断结果阴性CDC+D合计A+CB+D4+B+C+D结臬有浑浊或表面漂浮物，呈酒红色。紫外可见分光光绡果度计连续扫描，制备的胶体金在524.2

19、nm出现最大2.1胶体金的鉴定吸收峰，其余波长无吸收峰出现。由K=0.4271X+制备的胶体金溶液肉眼观察清亮透明，液体没514.56回归方程计算可得平均粒径为22.57nmo波长/nm图1胶体金400700nm吸收光谱Fig.1Visible-lightspectrum(400-700nm)ofcolloidalgold2.2胶体金最佳标记蛋白量及最佳标记pH未加抗体的对照管和加入抗体的量不足以稳定胶体金的各管均呈现出由红变蓝或灰的聚沉现象,而加入抗体量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1.0mL胶体金溶液红色不变的最低抗体用量为标记抗体的最低用量。确定标记抗体的最低用量后在进

20、行标记时须增加20%的抗体量。因此每毫升胶体金溶液确定加入单抗7C8的最低用量为6|1L,最佳标记鼠为每毫升胶体金溶液需加入36jig抗体。观察不同pH胶体金溶液标记前后的颜色变化，pH为6.0.6.5、7.0的胶体金溶液在标记后呈现出由红变蓝或灰的聚沉现象，pH在7.5以上的胶体金溶液，其颜色在标记前后无显著变化。因此,确定pH为7.5为单抗7C8的最佳标记pH。2.3H-FABP快速检测试纸条的性能验证2.3.1特异性将50瞄/mL的C反应蛋白、10jig/mL的人肌钙蛋白I、5jig/mL的肌酸激酶同工酶、15必/mL的人心肌肌红蛋白各取100滴加到试纸条的样品垫上,15min内观察，结

21、果均为阴性，均无交叉反应。2.3.2灵敏性H-FABP质量浓度分别为80、40.20ng/mL的参考品在T线均出现明显红色条带，10ng/mL的参考品在T线出现隐约可见的红色条带，判定为阳性。5ng/mL的参考品、阴性对照在T线均未出现红色条带。因此，试纸条的最低检测灵敏度为10ng/mL。2.3.3稳定性制备的试纸条放置于3638分别于第3、6、9、15、21天用参考品检测，结果符合参考品要求;将试纸条放置于22-24X,分别于第1、4、8、12、16、20月用参考品检测，结果符合参考品要求。因此，试纸条在3638Y及2224P条件下，性能稳定。2.3.4精密性两批试纸条用精密性参考品重复检

22、测，每条试纸T线颜色无明显变化，试纸条批问、批内精密性良好。2.4临床样本检测应用H-FABP快速检测试纸条检测120份临床阳性样本、120份临床阴性样本，检测结果与临床诊断结果进行配对分析,阳性符合率95.83%,阴性符合率100%、总符合率97.92%（表2）°表2试纸条检测结果与临床诊断结果Tab.2ConformitybetweenH-FABPkitandclinicaldiagnosisresults试纸条检测结果合计阳性阴性临床诊断结果阳性阴性11505120120120合计1151252403讨论急性心肌梗死发病后03h是治疗的黄金时间。因此，通过病史、查体、心电图和心

23、肌损伤标志物的检测快速识别出早期急性心肌梗死（发病时间6h内）患者并及时治疗是提高其存活率、改善预后的关键。临床常用的心肌损伤标志物有cTnI、CK-MB,它们在AMI症状出现46h才开始升高，诊断窗口常存在于AMI的中晚期，适用于回顾性诊断不适用于早期对AMI的辅助诊断：购。研究结果显示,H-FABP在胸痛发作后12h内对AMI诊断均有较好的敏感性（86%97%）.特别是对胸痛03h病人诊断敏感性为86%,特异性为76%,SROC曲线下而积为0.8892,H-FABP在胸痛发作后06h患者有最好的诊断效能SROC（AUC=0.915）,而这正是胸痛患者入院就诊的关键时间窗。因此，无论是在敏感

24、性和特异性上，还是在时效性上，HFABP都具有综合优势,可作为AMI早期筛查比较敏感且特异的指标,尤其是临床对AMI发生3h之内的早期患者的诊断更具有实用价值.目前，国内外检测H-FABP的方法有：双抗体夹心酶联免疫法、时间分辨免疫荧光测定法、光栅耦合传感器技术、微粒增强免疫浊度测定法、免疫传感器测定法等，这些方法虽然可以定量检测，但检测时限K操作复杂,且需要专业的检测设备和专业的工作人员，不能检测单份样本,不适宜床边或急诊室的快速检测。研究制备的人心脏型脂肪酸结合蛋白（H.FABP）快速定性检测试纸条，采用双抗体夹心固相免疫胶体金层析法定性检测人血清、血浆或全血中的H-FABP。检测时，样本

25、中的H-FABP先与胶体金标记的抗H-FABP单克隆抗体7C8结合成复合物，该复合物随着硝酸纤维素膜的毛细管作用迁移至检测区（T线），与包被在检测区的抗H-FABP单克隆抗体2G4结合.如果待测样本中的H-FABP质量浓度大于10ng/mL,则出现一条色带，而且样本中H-FABP的浓度越高，检测线区出现色带的时间越短、显色越深。不论待测样本中是否存在H.FABP,当液面继续迁移至包被兔抗鼠IgC抗体的质控区（C线）时，在该区出现另一条色带。该试纸条操作简便（不需仪器设备、仅用肉眼即可判读结果），适合在任何场所检测（采用手指血检测，病人无须做任何其他处理，仅备一个指尖采血针即可在家里、医院的急诊

26、室及床边进行检测），快速（检测全过程仅需15min）,-步完成（用指尖采血针采手指血点样后等待15min肉眼看结果即完成检测）。由于临床样本中可能含有胆固隔、甘油三酯、edta、肝素钠等物质,检测这些样本时T线均未显色,C线显色明显，未对检测结果造成影响.检测含有血红蛋白的样本时，硝酸纤维素膜背景变红，无法观察结果。因此，发生溶血的样本不能用于检测。通过对试纸条的性能验证，结果表明试纸条有良好的敏感性、特异性、稳定性，可用于早期AMI的辅助诊断。试纸条的不足之处是不能定量，限制了在评估心肌梗死面积及动态观察进行性心肌梗死方面的应用。参考文献1Pe&rsMM,HermensWT,Glat

27、zJF,etal.Fattyacid-bindingproteinsasplasmamarkersoftissueinjuryJ.ClinChimActa,2005,352(1/2):15-35.2AlhadiHA.FoxKA.Doweneedadditionalmarkersofmyocytenecrosis:thepotentialvalueofheaitfattyacid-bindingproteinJ.QJM,2004,97(4)：187-198.3NakataT,HashimotoA,HaseM9eta).Humanheart-tjpefattyacid-bindingproteinasanearlydiagnosticandprognosticmarkerinacutecoronarysyndromeJ.Cardiology,2003,99(2):96-104.4SeinoY,TomitaY,TakanoT.etal.Officecardiologistscooperativesludyonwholebloodrapidpaneltestsinpatientswithsuspiciousacutemyocardialin