新城疫病毒HN蛋白的抑瘤机制及其研究进展.docxVIP

1、第2】卷第3期2014年9月天津农学院学报JournalofTianjinAgriculturalUniversityVbl.21,No.3September,2014文章编号：1008-5394(2014)03-0049-04新城疫病毒HN蛋白的抑瘤机制及其研究诳展高静2,董东晓】，龙雨清'，李萌'，李留安'，金天明15奢(1.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津300384：2.天津生机集团股份有限公司，天津300384)摘要：新城疫病毒囊膜上较大的纤突样糖蛋白由新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶(HN)基因编码。HN蛋白即血凝素-神经氨酸酶蛋白，它不仅介导病毒吸附于肿

2、瘤细胞，而且与融合阪白一起帮助病毒侵入肿瘤细胞,其神经氨酸酶活性能水解宿主细胞表面的唾液酸，暴露宿主细胞的生物识别位点。它还能够水解病毒粒子表面糖链末端的唾液酸，防止病毒粒子在宿主表面簇集，并旦能够引入新的粘附因子和免疫原性分子，诱导机体免疫系统识别。关键词：新城疫病毒；HN蛋白；抑瘤机制中图分类号：S857.4文献标识码：AAntitumorMechanismofNewcastleDiseaseVirusHNProteinandItsResearchProgressGAOJing1,2,DONGDong-xiao1,LONGYu-qing1,LIMeng1,LILiu-an1,JINTian

3、-ming1'顷心卬就洒小。(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China;2.TianjinShengjiGroupLimitedCompany,Tianjin300384,China)Abstract:Thelargespike-likemembraneglycoproteinsfromtheNewcastlediseasevirusenvelopewereencodedbyNewcastlediseasevirushemagglutin

4、in-neuraminidase(HN)gene.HNproteinistheabbreviatedformofhemagglutinin-neuraminidaseprotein,itnotonlymediatesvirusadsorptionontumorcells,butalsomakesvirusinvadetumorcellswiththehelpofthefusionprotein,anditsneuraminidaseactivitycanhydrolyzesurfacesialicacidofthehostcellsandexposethebiologicalrecogniti

5、onsitesofhostcells.Itisalsoabletohydrolyzesialicacidlyingonsugarchainendofvirusparticlesurface,preventvirusparticlesfromclusteringonthehostsurface,furthermore,itcanintroducenewimmunogenicfactorsandadhesionmoleculestoinducetherecognitionofimmunesystems.Keywords:Newcastlediseasevirus;HNprotein;antitum

6、ormechanism收稿日期：2013-10-18基金项目：国家白然基金项目,TRAIL和H、基因重组腺病毒的构建及其对禽白血病肿瘤细胞的抑制作用”(31072109);天津市高等学校科技发展基金项目“APPlS影载体猪巴氏杆弟基因疫苗的研究°(20060720);天津市自然科学基金重点项目“Ad-TRAIL-2A-HN的构建及其对MD肿瘤细胞的抑制作用”(12JCZDJC22100)作者简介：高伸(1982-),女，天津市人，工程师，硕士，研究方向为中兽药新药研发及兽医生物技术与疫苗。E-mail：gj090329。通信作者：金天明(1968-),男,内蒙古通江人，教授，博上，主

7、要研究方向为分子免疫病理学。E-mail：。自1990年人类首次进行疾病的基因治疗试验以来，基因疗法作为一种全新的治疗手段日益引起人们的重视，特别是对现在还不能使用传统医疗手段彻底治愈的恶性肿瘤，基因治疗已成为该领域的研究热点和发展趋势，其核心策略之一是通过基因重组等手段将目的DNA转染入患者的肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡，从而达到治疗疾病的目的。因此，选择能高效、特异地增强肿瘤细胞凋亡作用的目的基因成为该领域研究的关键和难点。口前，新城疫病毒的抗肿瘤作用逐步为人们所重视并已转入临床研究阶段，有分析表明，通过HN蛋白的筛选能够引起抗原变异，并且能控制当前流行的新城疫闵。1 NDV的结构特性NDV

8、是一种有囊膜、单链、不分节段的负链RNA病毒，在分类上属于副黏病毒科(paramyxoviridae)的副黏病毒亚科(paramyxovirinae)中的腮腺炎病毒属(rubulavirus),可感染禽类引起新城疫气NDV的基因组包括6种基因，分别编码6种结构蛋白，据分布位置不同可分为内部蛋白和外部蛋白。内部蛋白包括核衣壳蛋白（nucleocapsid,NP）、磷酸化蛋白（phosphateprotein,P）、高分子质量RNA聚合前（largeprotein,L）;外部蛋白包括融合蛋白（fusionprotein,F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白及基质蛋白（matrix,M）oNP、P及L蛋白在

9、功能上相互促进，共同参与病毒RNA的转录和复制。其中，覆盖在病毒囊膜表面的血凝素和神经氨酸酶（HN）活性的糖蛋白、融合糖蛋白（F）以及脂膜内的非糖基化内膜蛋白（M）与病毒的脂质膜有关，即HN和F蛋白为糖基化蛋白，构成NDV的纤突，是NDV重要的免疫原成分。M蛋白为囊膜内表面支撑物，与F蛋白具有协同作用，共同形成具有感染性的病毒粒子。另外3种蛋白，即核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）和高分子质量蛋白（L）与基因组RNA有关HN蛋白的结构与功能NDV中HN基因是构成NDV囊膜上较大的纤突样糖蛋白的主要编码基因，其基因长1734bP,编码577个氨基酸，蛋白分子质量约63kD,兼有血凝素（HA）和神经

10、敏酸酶（NA）双重活性。其中，HA负责识别易感细胞的唾液酸受体并进行吸附，实现病毒感染细胞的第一步过程。NA则水解.宿主细胞表面的唾液酸，分解并破坏受体，暴露宿主细胞的生物识别位点，促进新生病毒粒子从感染细胞膜上释放，同时，其还具有活化巨噬细胞、自然杀伤细胞、稳定活化的】'细胞的作用气受体的识别取决于NA活性，但调节NA活性的HN残基在促进病毒吸附作用方面并非不可或缺，也就是说,NA活性发挥还需要其他HN蛋白的介导才能与受体结合。此外，HN蛋白还可直接作用于受体位点，并具有促进F蛋白融合作用的启动功能，HN蛋白通过去除新合成病毒核衣壳蛋白上的唾液酸，对子代病毒粒子进行加工，使F蛋白充分

11、接近细胞，完成病毒与细胞膜的融合。有研究结果表明，嵌合体位FM（l+2）,包含SV41融合衍生结构域Ml利1M2,共表达SV41HN蛋白介导的细胞间融合，表明这些结构域参与决定HN蛋白的特异性。现12确定，HN蛋白中的E401、R416和Y526位氨基酸残基对细胞与受体结合以及促进融合发挥着重要作用。应用单克隆抗体技术研究发现，HN蛋白的主要疏水区在N末端，即N末端是与病毒外膜的连接部位。在由75个钳:基酸残基构成的N末端中，第126位氨基酸残基为胞质内区（尾部）,第27-160（*氨基酸残基为跨膜区（杆状部）,其余氨基酸残基为胞质外氨基酸（球形头部）o相对来说，各毒株HN蛋白的氨基酸差异主要

12、集中在N末端第175位，自第76位氨基酸起至C端的整个膜外区，氨基酸差异较小。跨膜区和膜内区均参与HN四聚体结构的形成，当二者缺失时，HN蛋白只能形成二聚体结构叫HN蛋白中HA与NA两个抗原位点是相互独立的，即HA活性位点靠近HN蛋白C末端，NA活性位点位于HN蛋白中心。但在一级结构中，其第193201位基基酸残基同时参与了这两种结构的形成，因此，这两个活性位点町能存在某种程度的折叠气HN亚单位间通过二硫键形成二聚体，两个二聚体以非共价键形成四聚体,故成熟的HN为四聚体寡聚蛋白。对于强毒株NDV-AV而言，每个同型二聚体的亚单位都是通过球形结构域中第123位半胱忽酸（Cys）的二硫键相连接，其

13、中球形头部由多个0片状结构域构成,第175228位、第237287位、第316396位、第401443位、第472515位和第520571位氨基酸分别为81、82、63、64、85和86（图1）。球形头部含有NA活性位点、受体识别位点和已知的所有抗原位点气HN蛋白含有6个潜在的糖基化位点，其中4个（119、341、433、481位氨基酸）保守性强，2个（508和538位氨基酸）保守性较差。糖基化作用不参与HN蛋白的转运，但对NA活性的形成是必需的。新城疫病毒融合蛋白特异性序列对胞外构象的活化、蛋白间的相互作用极其重要同。上述研究表明，HN蛋白在抗肿瘤方面不但介导了病毒吸附肿瘤细胞的过程，同时还

14、与融合蛋白一起协助病毒侵入细胞。4014U449498GAEGARRfUCNTTV$47NDVHN1741761瞬401416449498$26MPSDNKKSCSGAEGARRfUCNTTVY_C%浏诵J5S图1HN蛋白的球形结构域和6个0片状结构域2 HN蛋白的抑瘤活性及其机制自从发现NDV能够抑制肿瘤细胞以来，HN蛋白的抗肿瘤作用就一直受到研究者的重视。已进行的I期临床试验显示，HN蛋白对恶性黑色素瘤和一些消化系统恶性肿瘤具有良好的治疗效果。通过静脉注射，HN蛋白可选择性杀伤多种肿瘤细胞,却对正常细胞无明显的毒副作用气随着NDV抗肿瘤机制研究的不断深入，HN蛋白在NDV抗肿瘤过程中发挥的

15、作用日益受到关注。HN蛋白抗肿瘤的机制主要表现在以下几方面。3.1去除肿瘤细胞表面唾液酸，促进T细胞识别细胞发生突变或癌变后，存在许多导致肿瘤细胞逃避免疫监视的机制。其中，唾液酸(sialicacid,SA)遮蔽是主要原因之一。SA位于细胞表面，它既有掩盖细胞膜、阻止细胞被识别的功能,同时其自身又能形成特殊的识别位点，从而遮盖细胞表面抗原，导致机体免疫细胞无法正确识别”气因此，不能发挥对肿瘤细胞的杀伤作用。SA作为细胞膜糖蛋白的重要组分，在机体组织和体液中广泛分布，参与细胞的识别、黏附和接触抑制等过程。SA已成为临床上一种广j普肿瘤标志物，可通过对血清中SA浓度的测定，将其作为诊断肿瘤的辅助指

16、标和疗效观察指标。临床检测结果显示，肿瘤细胞表面SA的含量明显高于正常细胞，细胞表面抗原因受到SA的遮蔽而无法被免疫细胞识别，因此，使肿瘤细胞逃避免疫防御而得以扩散。HN蛋白通过HA位点与肿瘤细胞表面SA结合后，在NA的作用下,SA从肿痛细胞表面脱落,导致细胞表面负电荷减少，细胞间排斥力降低，这更利于肿瘤细胞与淋巴细胞的接触和抗原信息的传递。由于SA的脱落，使原本被遮蔽的肿瘤抗原也得到充分暴露，导致肿瘤细胞免疫原性随之增强。以禽痘病毒为载体，将HN基因导入B16肿瘤细胞实现了HN蛋白在细胞膜上的表达，且B16细胞表面的SA含量显著降低，表明单纯表达HN蛋白也可获得HA识别、结合SA受体以及NA

17、降解SA活性的效应“°'。3.2HN增强肿瘤细胞表面的粘附性肿瘤细胞因缺乏黏附分子和共刺激分子而难以诱导产生特异性CTL反应。HN能在肿瘤细胞表面产生类似于抗原细胞表面的黏附分子和共剌激分子，即在增强淋巴细胞黏附力的同时，还可刺激淋巴细胞分化，激活淋巴细胞有研究报道，经HNcDNA修饰的肿瘤细胞制备的瘤苗，可增强抗原递呈细胞的活性，诱发动物及病人产生全身性的抗肿瘤免疫应答，NDV诱导肿瘤特异性CTL反应的主要途径是通过HN分子的细胞黏附和血凝活性实现的，同时还证明NDV的抗肿瘤作用与NDV颗粒表面HN的活性有关向。有研究表明，新城疫病毒的F蛋白和HN蛋白在感染过程中发挥着关键

18、性作用，NDV中的Anhinga/93替换成F或HN基因能显著提高病毒巨噬细胞的复制能力凹。3.3HN促进效应细胞的活化和肿瘤细胞凋亡免疫系统中大部分细胞都可表达TRAIL,单核-巨噬细胞和树突状细胞接受I型干扰素(IFN-a)和II型干扰素(IFN-Y)刺激后，可以检测到TRAIL的表达凹。其原因是病毒感染后，干扰素表达水平上调，继而诱导TRAIL表达。体内试验也表明，鼠肝脏NK细胞在经受IFN-Y刺激后，TRAIL表达上调，增强了NK细胞抑制肿瘤细胞向肝脏转移的细胞毒性叫。研究发现，M经NDV剌激后，可杀伤各种人类肿瘤细胞，M中的杀肿瘤特性正是通过TRAIL介导的叫NDV诱导M。表达TRA

19、IL时不依赖于病毒的复制，经紫外线灭活的NDV0燃具有诱导TRAIL表达的效果。进一步研究也证实，HN蛋白介导了NDV刺激下外周血单核细胞对IFN-a和TRAIL分泌的调节作用问。3 HN蛋白抑制肿瘤的应用前景鉴于在I期临床应用时使用NDV感染治疗有散毒的潜在危险，目前的研究方向是将NDV的抗肿瘤HN基因进行克隆，以抗肿瘤基因的真核重组体的表达产物取代完整病毒，从而克服了完整病毒所引起的副作用及可能带来的风险，进而确保安全性和细胞疫苗无法比拟的优越性，这为HN作为生物制剂替代NDV全病毒用于抗肿瘤治疗提供了科学依据。在由NDV介导的抗肿瘤过程中，HN蛋白具有增加肿瘤细胞对淋巴细胞的粘附力、刺激

20、淋巴细胞的分化和改变肿瘤细胞免疫原性的作用，因此，HN蛋白是NDV抗肿瘤作用的主要分子基础，在人类肿瘤性疾病生物防控中具有较高的研究和应用价值。NDV抗肿瘤作用的机制之一是通过病毒感染肿瘤细胞，增强肿瘤细胞的免疫原性，刺激机体免疫系统针对肿瘤抗原产生免疫反应，进而杀伤肿瘤细胞。但目前的研究与应用大部分还都局限于全病毒修饰疫苗或NDV溶痛株体外裂解瘤细胞，而后再回输入体内。显然，利用这种方法抑制肿瘤存在一定的风险。具体体现在：(1)利用病毒进行体内实验时不可避免地会产生抗体，这些抗体在很大程度上限制了病毒的反复使用，这是制约NDV进一步应用于抗肿瘤临床治疗的关键技术问题之一。(2)若体内试验中瘤

21、细胞灭活或裂解不彻底，会产生人为种植肿瘤的危险。(3)NDV可能对机体造成感染，存在散毒的风险，并且其非有效成分还町能导致机体出现过敏反应。尽管如此，利用NDV治疗肿瘤的研究方兴未艾，它是一种令人鼓舞的基因治疗手段。但生物疗法毕竟尚未完全成熟，尤其是、DV抗肿瘤的确切机制尚未完全阐明，因此，在该领域还需进行更深一步的研究和探索。参考文献：(1JGuM,LiuWJ,XuLJ,etal.Positiveselectioninthehemagglutinin-neuraminidasegeneofNewcastlediseasevirusanditseffectonvaccineeflicacyfj

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