新孢子虫抗原及疫苗研究进展.docx

1、新抱子虫抗原及疫苗研究进展王雪。孟庆峰，刘新欣】，王琪I,姚贵哲。王伟利微.<1,吉林农业大学动物科技学院，吉林K舂130118；2.吉林出入境检验检疫局，吉林长春130062)摘要：新抱子虫病是由犬新抱子虫(Neosporacaninum生于牛、羊和犬等多种动物细胞内引起的一种原虫病。新抱子虫寄生于宿主体内可导致孕富流产或产死胎，以及新生幼畜运动神经障碍和神经系统疾病，给富牧业造成了很大的经济损失。近年来对新抱子虫抗原蚩白在虫体免疫中的作用研究成为新抱子虫病免疫学研霓的热点，新抱子虫抗原蛋白将在新抱子虫疫苗研制中发挥作用。目前还没有预防新抱子虫疫苗投入市场的报道。论文对新抱子虫的抗原蛋

2、白及其疫苗的研究进展进行概述，为疫苗的研制及相应产品的研发提供参考。关键词：新抱子虫；抗原；疫苗中图分类号:S855.9文献标识码：A文章编号；1007-5038(2015)12-0129-05收稿日期：2015-05-14基金项目：质检公益性行业科研专顼(201410061)作者简介：王雷(1992)，女，吉林四平人，硕士研究生，主要从事动物寄生虫学研究.，通讯作者新抱子虫是一种顶覆门专性细胞内寄生虫，最早由BjerkasI等在患脑膜炎和肌炎的幼犬中发现，由DubeyJP等命名为新抱子虫。新胞子虫可感染犬、牛、羊等多种温血动物，是引起母牛流产的主要原因，因此，新抱子虫病是一个兽医学上的严重问

3、题，在经济学上也具有重要意义。新抱子虫感染宿主细胞主要包括黏附和入侵两个过程。在这个过程中，虫体内的细胞器及其所所分泌的抗原起到重要的重要。首先细胞表面因子暴露的瞬间引起新抱子虫微线体分泌相关蛋白，开始其黏附过程，微线体蛋白与宿主细胞膜上的相应受体结合形成可以移动的连接区域，然后，棒状体分泌相关蛋白修饰宿主细胞，开始侵入细胞。在侵入的过程中，虫体形态不变，宿主细胞内陷形成纳虫空泡，使虫体居于其中，随后虫体棒状体蛋白、致密颗粒蛋白及一些其他因子对纳虫泡膜进行修饰，使其可以避免宿主细胞对纳虫泡的裂解作用。新抱子虫速殖子在纳虫空泡中进行繁殖2d3d后，细胞破裂，新弛子虫速殖子进行下一轮的入侵。在此过

4、程中，虫体表面抗原、棒状体蛋白、微线体蛋白、致密颗粒蛋白等都起着至关重要的作用。新抱子虫入侵宿主细胞后，引起其细胞免疫反应及体液免疫反应。细胞免疫反应主要是新抱子虫的特异性抗原被抗原递呈细胞所识别并活T细胞，使其中CD4，T淋巴细胞中的Thl及Th2细胞分泌的细胞因子发生改变。新抱子虫的体液免疫主要是IgG抗体水平发生改变，所以新抱于虫疫苗的研究主要是对新弛子虫特异性抗原引起细胞免疫反应及体液免疫反应进行评估。新抱子虫是引起世界范围内牛流产的主要原因之一，目前最有效的防治方法是通过对检测后确定感染及疑似患病的动物进行淘汰，建立无新抱子虫感染的牛群，但是处置造成的损失同样不可估量。因此，有必要建

5、立一种有效的疫苗防止新弛子虫的传播。新弛子虫疫苗主要是抑制新弛子虫对宿主细胞的感染，并对宿主细胞提供一定的保护。现在已经研究的疫苗方法主要有灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亚单位疫苗、基因疫苗、活载体疫苗等方面的研究并取得了很大突破。论文主要对新抱子虫在黏附入侵过程中分泌的抗原蛋白及根据其研制的疫苗进行概括。1新抱子虫抗原1.1虫体表面抗原新抱子虫的虫体表面抗原主要有NcSAGl.Nc-SRS2、NcP0、p38、NcP29和NcP40等蛋白。Nc-SAG1与NcSRS2是新胞子虫重要的虫体表面抗原.NcSAGl仅在速殖子阶段表达,NcSRS2在速殖子与缓殖子阶段均表达，它们在介导虫体入侵细胞中起

6、到重要的作用。NcSAGl与NcSRS2是免疫与检测试验中常用的抗原，它们具有较好的免疫原性，以其制备的重组疫苗可有效阻断新施子虫对小鼠的入侵。NcSAG4在缓殖子阶段表达的蛋白，在新抱子虫感染细胞的周期中始终持续存在槌】。高建伟等人用P0基因制备DNA疫苗，证明DNA疫苗能够激起细胞免疫反应，具有很好的保护原性杨滨僮等人用PCR方法扩增P40基因，构建pET-28a-P40质粒并成功在大肠埃希菌Rosscta(DE3)中表达，证明了P40基因具有很好的免疫原性，可以作为疫苗的候选基因：刃。1.2致密颗粒抗原致密颗粒蛋白GRA在形成带虫空泡时起到重要的作用，目前已经被评价为候选抗原的有NcGR

7、Al,NcGRA2,NcGRA6,NcGRA7以及Nc-MAG1等贾立军等用NcGRA7蛋白基因构建重组质粒pMD18-NcGRA7,并应用SDS-PAGE及Westernblot方法对其进行分析，证明其具有很好的免疫原性，可以作为疫苗的候选基因。金春梅等i对NcGRA2t基因进行克隆测序，通过对其编码蛋白进行分析，说明其编码蛋白具有很强的抗原性，可以做为疫苗的候选基因。MAG1在虫体弑附细胞过程中具有一定的介导作用，焦石对其进行克隆分析，并用其与7干扰素基因融合,构建重组质粒，证明其具有一定的免疫原性，为其疫苗的研究提供一定的理论基础NcGRAM是长为1215bp无内含子的基因，是新发现的一

8、种致密颗粒蛋白，其免疫原性至今还没有确定口“。1.3微线抗原微线蛋白是由新抱子虫顶端的微线体分泌的一类蛋白，目前已知微线抗原蛋白主要有NcMICl、NcMlC2、NcMIC3、NcMIC4及NcMIClO等。YinJG等购重组NcMIClO蛋白在大肠埃希菌中进行表达.并针对该蛋白的非重叠片段制备多克隆抗体，然后用EL1SA方法检测山羊血清中的抗体，对现有的抗原进行补充。AMA1是由微线分泌的顶膜抗原，是典型跨膜蛋白，在入侵对宿主细胞过程中具有一定的介导作用。郭焕平等W构建pMD18T-NcA-MA弟组克隆质粒并克隆到腺病毒中，为以病毒为载体的新抱子虫重组疫苗提供依据。SrinivasanS以R

9、IBI为佐剂，用重组NcMIC4蛋白免疫小鼠，可以引起体液免疫应答，IgGl水平明显升高，同时减少新胞子虫对脑的感染性，NcMIC4可以以作为疫苗的候选基因1.4棒状体抗原棒状体蛋白在新抱子虫虫体入侵及对纳虫空泡进行修饰的过程中起到了重要作用。日前已知的棒状体蛋白主要有NcROPl、NcR()P2、NcROP3、NcR()P4、NcROP8及NcROP30。现在研究比敦多的是NcR()P2蛋白，也是确定的疫苗候选抗原之一。DebacheaK将NcROP2基因在大肠埃希菌中表达形成重组蛋白recNcR()P2并与乳化的弗氏不完全佐剂接种到已经感染新弛子虫的小鼠体内，结果是接种重组蛋白的小鼠存活率

10、比较高，其IgG水平明显升高，说明其对新抱子虫具有一定的免疫作用"助。新抱子虫的大部分基因都与弓形虫相似，有研究说明，棒状体蛋白可能与新弛子虫的毒力有关。LeiT用弓形虫的TgROP18基因转染新抱子虫上.构建Ncl-TgR()P】8,然后对其毒力进行分析，转基因的新抱子虫比野生新抱子虫的毒力强，确定ROP18是弓形虫与新抱子虫毒力差异的关键因素"刃，并且可能与新抱子虫入侵宿主细胞并在宿主细胞内繁殖有关。2新抱子虫疫苗2.1灭活苗灭活苗是指通过对虫体进行一定的处理使其失活，失去感染力和致病力，但保留其组成成分而制成的疫苗，具有安全性高、无毒力返祖现象等优点，但它不能激活细胞

11、的免疫反应，并且在灭活过程中可能会导致一些保护性抗原缺失匚AndrianarivoAG等网研制出一种疫苗，该疫苗用Havlogen和Polygen两种佐剂灭活新抱子虫的速殖子，Polygen能笏引起机体较高的抗体水平，具有较好的免疫原性，但是Polygen是否对，干扰素具有很强的刺激，目前还未明确，虽其不能预防妊娠奶牛的垂直传播，但通过静脉注射或肌肉注射能够达到一定的预防作用。Rojo-MontejoaS等用3种不同的佐剂灭活速殖子及3种不同虫体的数量来免疫小鼠，发现狙氧化铝与CpG寡核昔酸的混合佐剂能够防止新抱子虫病慢性阶段.阻止新抱子虫在大脑中增值。而H研究表明了不同佐剂使疫苗的疗效发生变

12、化七2.2弱毒苗弱毒苗又称弱毒活疫苗，是一种病原致病力减弱但仍具有活力的完整病原疫苗，也就是用人工致弱或自然筛选的弱毒株，经培养后制备的疫苗。此类疫苗可以剌激机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答等多种保护性反应。Marugdn-HerndndezV等应用Nc-1株的SAG4cl.1、转基因SAG4c2.1及野生Nc-l(WT)株制备活疫苗，并对已感染新抱子虫的怀孕小鼠进行免疫，小鼠病死率为40%、7%和5.6%,产后病死率分别为45%,11.1%和10.8%,证明了野生Nc-l(WT)株制备的弱毒苗对怀孕小鼠的免疫效果最好，也说明野生毒株的毒力弱。Rojo-MontejoS等履分离无毒力Nc-S

13、pain1H株，用5X1O5个活的Nc-Spain1H速殖子免疫小鼠，新生儿的病死率降低为2.4%,并激发Thl型免疫，将速殖子进行10倍稀释，低浓度速殖子可以引起IgG2a水平升高，高浓度速殖子能够引起IgGl升高.表明Nc-Spain1H能够防治新弛子虫病。但是目前还没有弱毒活疫苗可以用于预防新抱子虫的感染，一是因为弱毒苗依赖于体外细胞培养，需要大量的劳动力；二是已经用于预防牛流产的弱毒活疫苗，均导致了怀孕母牛流产，同时显示了活疫苗对孕畜具有一定的威胁。在此看来重组蛋白苗及亚单位疫苗对预防新弛子虫更具有吸引力和潜力3】。2.3重组蛋白疫苗重组蛋白疫苗是指将新抱子虫的目的抗原基因构建在表达载

14、体上，将已构建的表达蛋白载体转化到细菌中，在一定的诱导条件下，表达出大鼠的抗原蛋白，通过纯化后制备的疫苗。HeckerYP等仙】应用重组蛋白rNcSAGl、rNcHSP20和rNcGRA7制备免疫刺激复合物并对感染新弛子虫的怀孕的母牛进行皮下注射，发现rNcSAGl,rNcHSP20和rNcGRA7具有一定的免疫原性，但是不能阻止新抱子虫的垂直传播。LvQ等人重组、cP78和NcGRA7免疫蛋白并对Balb/c小鼠进行接种，发现重组的NcP78和NcGRA7能够引起Thl和Th2免疫应答，使IgGl和IgG2a抗体水平升高，此外，重组NcP78和NcGRA7可以减少新抱子虫在大脑的寄生及繁殖。

15、虽然这些疫苗不能缓解人工流产的症状，但是可以增加后代的出生数量，对小鼠感染新弛子虫具有一定的保护作用2.4基因工程亚单位疫苗基因工程亚单位疫苗是利用DNA重组技术，将编码病原体的保护性抗原的基因导入原核细胞或真核细胞.使其在受体细胞中高效表达，分泌具有保护性的抗原肽链。新抱子虫亚单位疫苗是提取新袍子虫具有免疫原性的蛋白，加以佐剂制成的3侦。OtsukiT等S证明10只桑蚕能够表达1.7mgSAG1,17只桑蚕能表达370MgSRS2,表明桑蚕的表达系统能大量产生重组抗原应用于亚单位疫苗的制备。贾立军等淘提取新抱子虫表面蛋白基因Nc-SAG1,进行原核表达，将经Westernblot鉴定具有免疫

16、活性的重组蛋白与弗氏佐剂混合制备NcSAGl基因工程亚单位疫苗，并免疫小鼠，检测抗体检的OD450nm值为0.688；CD4+/CD8+T细胞比值为3.650,均高于对照组，证明制备的基因工程亚单位疫苗具有一定的免疫效果。高建伟制备的新饱子虫3种不同佐剂亚单位疫苗按常规免疫程序免疫小鼠.测得3种佐剂亚单位疫苗的抗体效价及CD4+T细胞均高于对照组，具有一定的保护作用。2.5核酸疫苗核酸疫苗分为两种，即DNA疫苗和RNA疫苗，它可被细胞吸纳，并在细胞内表达生成疫苗抗原。与传统疫苗相比，核酸疫苗具有特异性高、安全性好、制备简单等特点。核酸疫苗既可以诱导机体产生保护性抗体.同时也可以引起细胞免疫反应

17、，特别是细胞T淋巴细胞(cTL)反应。贾文影构建新袍子虫核糖体磷蛋白NcPO喜核表达载体.转染Vero细胞，获得大量的pVAXl-NcPO质粒并添加佐剂免疫沙鼠，计算疫苗攻毒后pVAXl-NcPO组和添加Cp-M佐剂组的保护率分别为66.7%和70%,证明新抱子虫DNA疫苗能够激活机体细胞及体液免疫反应，对新弛子虫病具有一定的预防作用仆:。2.6活载体疫苗载体疫苗是用基因工程技术将保护性抗原基因(目的基因)转移到载体中使之表达的活疫苗。目前有多种理想的病毒载体，如痘病毒、腺病毒和疱疹病毒等都可以用于活载体疫苗的制备。郭焕平构建了含有AMA1基因的腺病毒载体疫苗及核酸疫苗，免疫Balb/c小鼠后

18、腺病毒载体疫苗的IgGJgGI及IgG2a均高于核酸疫苗，在一定程度上激活机体免疫反应贾立军以NcSRS2基因构建重组腺病毒，免疫小鼠测抗体效价为1：2048,证实了Nc-SRS2重组腺病毒可以作为疫苗预防新抱子虫病的可行性3。入3展望新弛子虫疫苗的研究主要是对新抱子虫特异性抗原引起细胞免疫反应及体液免疫反应进行评估。综上所述，确定的可以作为疫苗候选基因的抗原蛋白主要有表面蛋白NcSAGl和NcSRS2；致密颗粒抗原蛋白NcGRAl、NcGRA2、NcGRA6、NcGRA7及NcMAGl；微线抗原蛋白NcMICl.NcMIC3.Nc-MIC4、NcMIC10和NcAMAl；棒状体抗原蛋白NcR

19、OP2等。目前有大量的研究人员对新抱子虫特异性抗原进行筛选并用已知的试验方法测定其免疫原性的制备疫苗。现在研究比较广泛的主要有灭活苗、弱毒苗、基因工程亚单位疫苗、重组蛋白苗、核酸疫苗、活载体疫苗等。弱毒疫苗以及灭活疫苗是研究比较早的人疫苗，在一定程度上都有些不可忽视的缺点，因此在预防新弛子虫病上不是比较理想的选择。亚单位疫苗，重组蛋白疫苗以及核酸疫苗具有安全性高，稳定性强、制备简单、运输方便特点，在此看来可能比弱毒疫苗和灭活疫苗对预防新更具有开发力及潜力。活载体疫苗是现在-个研究热点，但是重复使用.可能使效果降低，还不是很理想，有待完善。虽然现在关于疫苗的研究有很多，但是还没有有效的疫苗被投入

20、市场来预防新弛子虫病，但是相信随着不断深入的研究，在不久的将来,一定能够突破难点，最终成为控制新抱子虫病的重要手段参考文献：1BjcrkasI.MohnSF,PrcsthusJ.UnidentifiedcystformingsporotooncausingencephalomyelitisandmyosiiisindogsJ.ZParasitenk.1984,70:271-274.2DubeyJP.CarpenterJL,SpeerCA.etai.NewlyrecognizedfatalprotozoandiseaseofdogsJ.JAmVetMedAssoc.1988.192.1269-1

21、285.3TomleyFM.SoldatiDS.Mixandmatchmodules：structureandfunctionofmicronemeproteinsinapicomplexanparasitesJ.TrendsParasitol,2001.1781-88.4武晓燕.黄院红.新抱子虫侵入宿主细陋的研究进展J.生命科学.2010,22(9,873-877.5K强.犬新抱子虫宿主细咆结合倍白筛选及其免疫原性分析D.吉林长春：吉林大学.2013.61杨演僮.新帽子虫P40和MIC6基因的免疫保护作用研究D.吉林长桥，吉林农业大学.2014.7 物演撞，赵仅，祝剔等.新抱f虫表面抗原P4

22、0基因的克隆及原核表达：J.中国生物制品学杂志.2014.7(6X789791.8 李M.T的李建华.等.新抱子虫NcSAG4基因克隆及原核表达J.中国病原生物学杂*.2012,7(6),446-448.9 商建伟.牛新袍子虫霓单位疫苗的研究CD-*林延边：整边大学,2011.10：QiangL.XingSY,GongPT,etal.A78kl)ahostcellinvasionproteinofNeosporacaninumasapotentialvaccinecandidateJ.ExpParasitol.2015,148:56-65.11 贸立军.张守发.李男礼.牛源犬新饱子虫NcGRA

23、7基因的克隆及原核表达分析J.中国预防*厌学报.2013,35(9).773-775.12 金春梅，于龙政，张守发.新抱子虫NcGRA2t基因的克隆与生物信息学分析J.延边大学农学学报,2013.35(4),313-316.13 焦石.贸世军.张立理.等.犬新抱子虫MAG1与IFN-y碓合基因重组质粒的构建及原核共表达J.中国曹医学报2013,33(3),386408.14 LiuGZ,CuiX.HaoP.eial.GRA】4.anoveldensegranuleproteinfromNetuporacaninumJ.ActaBiochemBiophysSin,2013,7,607-609.1

24、5'jYinJG,QuGG,CaoLL.etal.CharacterizationofNeosporacaninummicronemeprotein10(NcMIClO)anditspotentialuseasadiagnosticmarkerforneosporosisfJj.VetParasitol.2012,187,28-35.ri61郭焕平.牛源犬新抱F虫AMA1基因核酸疫苗与玫tfl腺病瀚疫苗的制备及动物免疫D.吉林廷边，延边大学.2014.17SrinivasanS.MuellerJ,SuanaA,etal.Vaccinationwithmi-croncmcproteinN

25、cMIC4increasesmortalityinmiceinoculatedwithNeosporacaninum£j'.JParasitol.2007,93(5)11046-55.18JDebacheaK.GuionaudbC,AlaeddinebE.etal.VaccinationofmicewithrecombinantNcR()P2antigenreducesmortalityandcerebralinfectioninmiceinfectedwithNeosporacaninumtachyzoitesjj.IntJParasitol,2008.38：1455-14

26、63.19LeiT.WangH.LiuJ,ctal.ROP18isakeyfactorresponsibleforvirulencedifferencebet-weentoxoplasmagondiiandNoesfloracaninumJ.PLoSOne,2014.9(6):c99744.20AndrianarivoAG.ChoromanskiL,MeIJonoughSP.etal.ImmunogenicityofakilledwholeNeosporacaninurntachyzoitepreparationformulatedwithdifferentadjuvantsJJ.IntJPa

27、rasitol,1999.29,1613-1625.21 Rojo-MontcjoaS.Collantes-FerndndczaE.Regidor-CcrrilloaJ.etat.InfluenceofadjuvantandantigendoseonprotectioninducedbyaninactivatcdwholevaccineagainstNeosporacaninuminfectioninmice.J.VetParasitol.2011.175：220229.22 Marugdn-HerndndezV,Ortega-MoraLM,Aguado-MartinezA,etal.Tran

28、sgenicNeosporacaninumstrainsconstitutivelyexpressingthebradyzoiteNcSAG4proteinprovedtobesafeandconferredsignificantlevelsofprotectionagainstverticaltransmissionwhenusedaslivevaccinesinmicefjJ.Vaccine.2011.44(29)7867-7874.：23RojoMontejoS»Collanles-FerndndczE.Lopez-PerezLetal.Evaluationoftheprote

29、ctionconferredbyanaturallyattenuatedNeosporacaninumisolateagainstcongenitalandcerebralneosporosisinmiccJ.VetRes.2012.43:62.doi：10.1186/1297-9716-43-62.24 MichaelP.DadinP.HemphillA.etal.AlivevaccineagainstNeosporacaninumabortionsincattleFJ.Vaccine.2015,33：)2991301.25 HeckerYP.CticeresV,WilkowskySE.et

30、al.ANtro$pvracaninumvaccineusingrecombinantproteinsfailstopreventfoetalinfectioninpregnantcaitlcafterexperimentalintravc-nouschanengcJl.VetImmunolImmunop,2014,162s142-153.26 收金水.弓形虫疫苗研究进展JJ.吉林畜牧WK.2014(7)：79.27(hsukiT,DongJH.KatoT.etal.Expression.purificationandantigenicityofNeosporacontnumantigensu

31、singsilkwormlarvaetargetingforsubunitvaccinesFJ1-VetParasitol,2013,192,284287.28 贾立卒.张守发，栾杨，等.牛新抱于虫NcSAGl基因工程亚单位疫凿的免疫试我J.布牧2010.42(1),2022.29 贾文影.新抱子虫PO基因的真核表达及DNA疫苗的初步研究D：.吉林延边：延边大学.2010.30 贾立军，于龙政，张守发.表达牛源犬新抱子虫、茁RS2基因政组腺病毒的构建及免疫原性分析J.备牧件灰学报.2012.3(43)i446-452.脂多糖的效应及其机理研究进展张晓音，吴旻，李雨萌，洪盼，尹剑，吉昱斌，刘海艳

32、，郑鑫(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118)摘要：脂多(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性菌的主要成分，具有双重作用，适量的LPS可以激发机体的免疫反应，增强其免疫功能，而高浓度则会引起广逝而强烈的炎性反应。在LPS介导的信号转导通路中，有LBP.CD14等多种双重作用的受体，与LPS的双重作用有关。论文对与LPS双重作用有关的受体以及LPS的机理进行综述，以期为LPS的使用和LPS引起的炎症疾病的治疗提供参考。文献标识码：A关键词：脂多蟾；双重作用；受体;信号转导中图分类号：S852.2脂多糖是革兰阴性菌细胞壁外膜中的主要成分，因只有当细菌死亡溶解或用人

33、工的方法破坏细菌后才能被释放出来，又称内毒素，能够激发机体的炎症反应，是临床上内毒素血症的主要诱因，由O特异性多糖、核心多糖和类脂A三部分构成。位于LPS外层的O特异性多糖具有亲水性，结构不稳定，决定LPS的抗原性。类脂A位于内层，是LPS的毒性中心和主要生物活性部分，高度保守,无种属特异性，所以不同的革兰阴性菌感染,产生的LPS的毒性作用大致相同。核心多糖位于两者中间，结构比较稳定，起到连接两者的作用。LPS在体内可以通过细胞信号转导系统激活单核巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞等，合成和释放多种细胞因子和炎性介质.进而引起机体一系列的反应。文章编号：1007-5038(2015)12-0133-041与LPS作用有关的受体1.1脂多糖结合蛋白脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide-bindingprotein,LBP)是一种I型急性期反应蛋白，先由肝脏和肠上皮细胞合成分泌成单链多肽,再经糖基化后形成糖蛋白。主要存在于人和动物的血清中,对类脂A有高度的亲和性，有璘脂转运作用。LBP不耐热,56C处理30min即可使其生物活性丧失70%以上，另外，在不同的动物种属之间，LBP具有高度的同源性。LBP的生物学功能具有浓度依赖的双重效应，低浓度时，启动致炎位点，引起增敏促炎效应;高浓度时,则启动抗炎位点，有抑制炎症