新西兰家兔颈动脉体外应力培养研究.docxVIP

1、新西兰家兔颈动脉体外应力培养研究付海洋I李敏2于浩，2付步芳，王召旭，1.中国食品药品检定研究院医疗器械检定所袁北京102629H2.烟台大学生命科学院袁山东烟台264000摘要0的通过调节液体流量尧流速及周期性脉动等参数袁研究新西兰家兔颈动脉体外应力培养时血管结构的变化遥方法取SPF级新西兰家兔颈动脉置于生物反应器上袁构建血管体外培养模型遥共分四组袁静态组为静态培养袁动态组渊80尧50尧25组冤在脉冲泵运行位移与频率相同的条件下袁保持培养液流速分别为80尧50尧25ml/min袁维持应力状态培养素培养结束后通过HEMassonEVG染色对血管结构的变化进行评价茂结果静态组15d血管内皮细胞保

2、持完整袁平滑肌细胞排列混乱袁弹性纤维收缩剧烈袁胶原纤维基本没有变化曰80组弹性纤维未见明显变化袁内皮细胞不可见袁第8天平滑肌较第4天排列整齐袁第8天胶原纤维明显减少遥50组内皮细胞不可见袁平滑肌排列整齐袁15d时弹性纤维疏松且趋于平直袁血管胶原纤维明显减少曰25组内皮细胞可见袁弹性纤维和胶原纤维改变较50组轻微遥结论在模拟动物体内各参数的条件下袁血管体外动态培养有助于维持血管的生理结构袁培养的难点在于防止污染和补充胶原遥高应力条件下袁会导致血管内皮细胞受损袁进而造成平滑肌细胞增殖袁胶原纤维流失更为严重遥关键词血管体外培养曰应力日生物反应器曰弹性纤维曰胶原纤维曰血管内皮细胞中图分类号R3文献标识

3、码A文章编号1673-7210渊2021冤11渊a冤-0004-04StudyoftheinvitrostresscultureofNewZealandrabbitcarotidarteryFUHaiyang1LIMin”YUHao12FUBufang*WANGZhaoxu11.InstituteofMedica.DevicesControl,NationalInstitutesforFoodandDrugControl,Beijing102629,China;2.ColllegeofLifeS<ience,YantaiUniversity,ShandongProvince,Yantai

4、264000.ChinaAbstractObjectiveTostudythechangesofvascularstructureinvitrostresscultureofcarotidarteryinNewZealandrabbitsbyadjustingalparametersoffluidflow,flowrateandperiodicpulsation.MethodsCarotidaneriesofSPFNewZealandrabbitswerepuiinabioreaciorioesiabIsh【hevesselculturemodelinvitro.Therewerefourgr

5、oups,thesialicgroupwasstaticcu1tire,andthedynamicgroups(group80,group50andgroup25)weremainhincdunderthesameoperatingdisplacementandfrequencyofpulsepump,andtheflowratesofculturemediumwere80,50and25ml/min,respectively,tmaimainthestressstatecuhure.Aftertheculire,thechangesofvascularsiructurewereevaluat

6、edbydHE.MassonaiEVGstaining.Resultasialicgroup,vascularendothelialceIs)reinaineiiiiaci,smoothmusclecellsinwerearrangeddisorder,clasgitcdrilEclcdsharply,andcollagenfibersbagtcuiit厚dunchangcdat1580,elasticdays.IngroupibersifchangHdugwificantlyandendothaia)cel1otliesouiiiiandthesmooth8thdaywasmuscleinh

7、emorehanthatin。出or攻thay,andcollagendfibasedsgnific故幻如6腴the8ith50,endothelialceday.Ingroupnotvisibe,smooth浦ecellsWerearraorder,elasticrifefcifcecameatthe15thdays,alooseandflatularcollagenfib的da&csreasedsignificantly.p25,thechangesfibersandcolagenfibersweremiIderhanthoseingroup50.ConclusionUnderth

8、e叫血仍口ofsimuiaiingvariousparametersinvivo,thedynamiccultueofbloodveseisinvitroisheipfu)tomain血physioogicalstructureofbloodvessels.Thedifficultyofcu1tureistopreventpollutionandsupplunentcollagen.Undertheconditionofhighehrlrsiieiiaicufeiih：widamaged,rbkib'flinginttionifcimusclecells。曲dihemoreseilag

9、enfibers.riouslossofcolKeywordsBloodvesselcultureinvitro;Stress;Bioreactor:Elasticfiber;Collagenfiber:Vascularendothelialcell近年来血管支架从材料到工艺都在不断优化发展袁为了能够更好地评价这类医疗器械的性能袁各种基金项目国家重点研发计划项目渊2017YFC1105000冤遥作者简介付海洋*1979.8-兢女直硕士克副主任药师日研充方向院医疗器械的生物学评价遥通讯作者付步芳11974.11-女克硕士W主任药师日研究方向,医疗器械的生物学评价苣王召旭汨963.5-魅男真博士质

10、研究员袁硕士生导师曰研究方向院医疗器械生物安全性评价遥评价方法不断发展I遥传统的动物实验是目前主要评价手段袁但该类方法耗时长尧影响因素过多遥体外组织学评价具有细胞评价和动物评价不可替代的特点袁比如其既可模拟动物体内的生理环境和流体力学环境袁又可通过设置参数尧添加试剂成分控制各种条件袁以探究各种因素所产生的作用遥但目前体外组织学评价研究受限丁体外血管组织培养袁发展缓慢康面临的难点主要是在保证无污染血管长期存活的基础上维持血管的组织结构和生理功能勇遥本研究主要旨在解决两个问题院一是如何实现长期无污染培养袁二是研究应力对血管结构的影响遥1材料与方法1.1实验动物成年健康新西兰家兔3用体重25H3.0

11、k兢SPF级京性别不限袁由中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所提供遥实验动物生产许可证号院SCXK渊京冤2019-0017号素实验动物合格证号找0.1103172011000144袁伦理号院中检动渊福冤第2019渊A冤054号遥1.2试剂MEM培养基iHyClone?日胎牛血清浦GibcoE日青链霉素双抗溶液IGibcoSHMasson染色试剂盒SSolarbioSBm二敏化铁水溶液趾海铭博生物冤日1瞰液渊Solarbi。冤遥1.3仪器BOSEElcciroForcc5200BioDynamic生物反应器1.4实验方法1.4,1分组每只新西兰家兔取两侧颈动脉袁各长8耀10cm袁取2cm做静

12、态培养对照袁另外各取3耀4cm渊其中2cm用于检测袁两头多出部分用于固定冤做25J50J80ml/min动态培养真每组重复3次遍以下简称静态组尧25组尧50组尧80组遥1.12获取血管获取家兔两侧颈动脉袁用P8S缓冲液轻柔冲洗213次至无残留血液遥1.U参数设置如图1所示组装生物反应器袁箭头所示为液体流动方向袁血管放置于反应舱内遥模拟兔子的心跳频率调节脉动泵的位移频率为3Hz/sB模拟兔子血管内的收缩压100mmHg浦1mmHg=0.133kPa甑舒张压95mmHg调节脉冲泵的位移遥调节蠕动泵袁控制培养基流速分别为25毗80ml/min菁图1生物反应器示意图1.4.4血管染色和观察培养结束后用

13、10%甲醛固定血管24h以上遥制备切片行HE尧EVG尧Masson染色袁并用显微镜观察内外膜尧弹性纤维尧胶原纤维等遥2结果HE染色如图2A源封三冤袁静态组0d血管形态正常袁内皮细胞完整袁内弹力板整齐曰图2B渊封三冤中静态组静态培养15d血管内皮细胞完整袁平滑肌细胞排列混乱日图2C渊封三冤中80组培养4d血管形态正常袁内皮细胞不可见袁平滑肌细胞排列混乱且松散袁内弹力板清晰日图2D渊封三冤中80组培#8d与4d比校袁内侧平滑肌细胞排列由混乱变为整齐日图2ET渊封三冤中50组培养10尧15d的血管形态相似袁未见内皮细胞袁平滑肌细胞排列整齐且细胞核为椭圆状袁呈现增殖状态袁内弹力板清晰遥图2GTI渊封三

14、冤中25组培养10d和15d血管形态均正常袁细胞排列整齐袁内皮细胞完整袁中膜内弹力板整齐遥EVG染色图2A渊封三冤静态组0d血管弹性纤维舒张且有序日图2B渊封三冤静态组静态培养15d血管中弹性纤维和0d比较收缩剧烈日图2C'D渊封三冤80组培养4尧8d血管弹性纤维未见明显变化日图2E渊封三冤和图2G渊封三冤5()组和25组l()d血管维持正常状态日图2F渊封三冤和图2嘲封三冤显示50组和25组培养15d和14d的血管弹性纤维较10d明显疏松旦趋于平直袁且50组条件下更为平直遥Masson染色静态组0d胶原纤维均匀分布在整个血管中膜日静态组15d血管中胶原纤维分布范围与0d基本一致日80

15、组动态培养4d的血管胶原纤维分布及含量保持较好日8()组培养8d血管胶原纤维明显减少袁红色肌纤维着色增多日50组和25组血管胶原纤维变化趋势与80组相同袁但速度慢遥见图2渊封三冤遥3讨论本研究中的体外血管培养在生物反应器中进行袁该装置包括血管培养仓尧蠕动泵尧脉动泵尧储液瓶及监测装置遥其复杂的结构袁增加了操作的难度和污染的可能袁其难点在于在保证无污染血管长期存活的基础上维持血管的组织结构和生理功能务舞1995年NathalieBardy等设计了一种体外培养模型袁加载不同的流量和流速袁血管存活了8d袁但整体装置较为简单袁不能模拟血流的周期性脉动'临2001年网做初设计了新型的血管体外应力培

16、养系统袁对血管施加定常流与脉动流袁稳定培养猪颈总动脉7d曰2006年袁张海燕"为研究冠脉支架再狭窄的机制设计了血管体外培养装置袁模拟r在体时血管内壁剪切力尧收缩舒张压尧流体层流等袁可做到稳定培养7d左右U2012年北京航空航天大学与四川大学联合研制了一种双循环生物反应器袁分别调控剪切力尧舒张压尧收缩压的大小袁施加定常流与脉动流袁但稳定培养时间过短1,43020,9州的年心尊l，5i和Daum等"分别运用生物反应器对组织工程血管进行了14dWd的培养遥综上体外血管组织的培养通常达到7d袁鲜有超过2周的记录遥本研究通过优化实验程序袁改善实验条件袁严格的无菌操作等袁使得血管在体外

17、动态培养的时间达到15d袁和目前国内外体外培养的最长时间基本一致遥血管管壁由三层膜构成袁最内层为内膜袁由平行排列的内皮组成曰中膜由多层环形平滑肌纤维组成曰外膜由纤维细胞袁纵行的胶原纤维束和薄弹力纤维共同组成5签新西兰家兔的血液正常流速为25miming为了研究高流速对血管结构的影响袁本实验中动态组设了流速分别为50ml/min和80ml/min的50组和80组袁流速加快会造成血管受到的剪切力增大袁内皮细胞会变得更细长广遥本研究中袁动态组血管HE染色切片中未见到明显内皮细胞袁一方面可能是因为细胞变细K后未切到细胞核袁另一方面可能是在取血管时的拉扯损伤了内皮细胞袁或高应力环境导致内皮细胞易脱落遥血

18、管平滑肌细胞的主要功能是调节血管的口径尧保持血管支撑力袁正常应力下保持排列整齐且细胞核为长梭型叶遥静态组静态培养15d由于血管失去应力环境导致血管平滑肌细胞生长方向变得混乱曰应力突然增加导致80组4d平滑肌细胞排列发生变化袁但8d时血管逐渐适应了新的应力环境袁从外侧细胞开始逐渐恢复整齐曰50组出现细胞增殖的情况袁可能的原因是内皮细胞受损后袁切应力直接作用于平滑肌细胞袁引起了细胞增殖与凋亡的失衡*却曰25组内皮细胞和平滑肌细胞基本维持正常状态遥弹性纤维是血管的主要功能成分袁对维持血管弹性回缩起着重要作用狗遥正常血管的弹力纤维形状清晰袁呈疏松的波浪状有序排列遥静态组血管在离体后失去了在体时的压力尧

19、应力尧载荷等袁随着培养时间的增长袁血管发生收缩形变袁弹性纤维与刚取出时比较呈现收缩状态遥动态组固定时保持了在体长度袁维持体内应力环境袁不同流速下弹性纤维的形态基木保持不变袁均排列有序袁提示本实验中施加的应力尚在弹性纤维的承受能力范围内遥胶原纤维为血管提供一定的刚度及强度袁与弹性纤维共同维持血管壁的力学功能严遥胶原纤维的弹性模量比弹性纤维和平滑肌高袁是力的主要承担者遥静态组血管未受到力的刺激袁胶原纤维没有流失曰而动态组血管处于应力的环境中袁胶原纤维承受力的同时也在慢慢降解袁由于离体培养时没有添加合成胶原纤维的成分袁故在培养到15d时袁胶原纤维降解最为严重袁呈细丝状日不同流速的条件下袁80组在培养

20、8d时已经能够看出胶原纤维呈细丝状袁而50组在15d时呈现相同店I由此可见袁应力越高袁胶原纤维降解的速度越快遥本研究在应力条件下体外培养血管15d袁和目前国内外体外培养的最长时间基本致严遥结果显示袁在模拟动物体内各参数的条件下袁血管体外动态培养有助于维持血管的生理结构袁但高应力条件下袁会导致血管内皮细胞受损袁进而造成平滑肌细胞增殖袁胶原纤维流失较为严重遥今后的研究工作应重点关注防污染袁延长培养时间曰培养过程中及时补充胶原袁防止胶原蛋白流失遥参考文献：1杨广鑫袁栾景源.生物可降解金属血管支架研究进展J.中国微创外科杂志袁2018袁209渊8冤院753-757袁760.2 郑玉峰袁杨宏韬.血管支架

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22、cularizcdMicrolumorModels：J,Micromachines浦Basel兢2018直9渊10冤院493.6 MenonNVftTayHM克WeeSN克etal.Micro-engineeredperfusable3DvasculaturesforcardiovasculardiseasesJ.LabChip懿017就7*17麟2960-2968.jAichisonLiAbuialebNO费Snyder-MounisE克etal.iPSCDerivedEndothelialCellsAffectVascularFunctioninaTissue-EngineeredBloo

23、dVesselModelofHutchinson-GilfordProgeriaSyndromeJ.SiemCellReports克2020克14熬妹325-337.8 ScicchitanoP集CorteseF克GesualdoM$etal.Theroleofendothelialdysfunctionandoxidativestressincerebrovas®culardiseasesJ.FreeRadicRes直2019衰53讲6夏氏579-595.9 vanDuinenV索vandenIleuveiATrietschSJetal.96perlfusablebloodvess

24、elstostudyvascularpermeabilityinvitlroJ.SciRep袁2017隶7溯1鬼院18071.10 GongMM有Lugo-CintronKMIWhiteBRetal.Humanorganotypiclymphaticvesselmodelelucidatesmicroenfvironment-dependentsignalingandbarrierfunctionJ.Biomaterialsl20191214119225.11 BardyNsKarillonGJMervalRetal.Differentialeffectsofpressureandflowon

25、DNAandproteinsynthesisandonfibronectinexpressionbyarteriesinanovelorganculturesystemJi.CircRes吏1995京77黑4裁684-694.渊下转第16页冤于纯森袁刘宁袁宫铭海袁等.黄精药理作用研究进展及在保健食帝领域的应用开发J.黑龙江科学袁2019袁10渊18冤院66-68.11 蔡萍袁刘才英袁梁雪娟袁等.杜仲药材有效成分与环境因子的灰色关联度分析J.中国实验方剂学杂志袁2014袁2012310-14.12 LamontSiBruneroStLyonsSftetal.CollaborationaSmong

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27、ssageusersbasedontheirdemandfortextmessaging站AbehavioraleconomicapproachJ.ExpAnalBehav克2019克112113273-289.16 徐伏牛.论野药食同源冶与保健食品开发J.安徽预防医学杂志就002噩贱142-143.17 杜英俊袁张丽军袁邢波.浅谈大量应用药食同源物品的危害：JL黑龙江医药克2004粕转66-67.：18余世望袁肖小年袁范青生袁等.60种药食两用植物抗氧化作用研究JL食品科学tl995i?llB3-5.J9张翼袁徐子刚袁唐弥烧.药食两用中药材中元素含量的测定J.浙江大学学报院理学版袁2008渊

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