生防菌株TL2的菌剂研制及大田防病试验.docx

1、中图摩孕通掘2009,25(17):181-185ChineseAgriculturalScienceBulletin生防菌株TL2的菌剂研制及大田防病试验洪永聪（青岛农业大学茶叶研究所，山东青岛266109）摘要：以一株能在茶树体内内生定殖、对茶叶斑病防病效果好的枯草芽抱杆菌（8s沮U3S泌Mis）菌株TL2为研究对象，优化该菌株的发酵条件和生产工艺，筛选它的适宜助剂，测定它在大田对茶叶斑病的防病效果。结果表明：该菌株的最佳产阮条件为氮源（蛋白踪）、培养温度（35P）、碳源（蔗糖）、培养时问（72h）、初始pH6.6和250ml装液量（50ml）。它的最佳固态发酵工艺为象源（豆饼扮）、碳源（

2、我皮）、含水量（25ml）、接种量（4%）、培养温度（35P）和初始pH7.0。筛选得到该菌剂的4种良好栽体，碳酸钙、高岭土、滑石粉和硅藻土等，1种良好的润湿分散剂，木质素横酸钙，以及2种优良的紫外保护剂，腐核酸和糊精。该菌剂（抱子粉可湿性粉剂）在田间对茶叶斑病有较好的防治效果，防效达70%以上，与对照药剂多菌灵的防治效果相当。关键词：生防菌；枯草芽抱杆菌；茶叶斑病；菌剂；防病效果中图分类号:S435.711文献标识码:A论文编号:2009-0927MicrobialInoculumofBiocontrolStrainTL2anditsEffectofProventingDiseasesinF

3、ieldHongYongcong(TeaResearchInstitute,QingdaoAgricultureUniversity,QingdaoShandong266109)Abstract：BacillussubtilisstrainTL2wasstudied,whichwasprovedtobecolonizeinsideofteaplantandhadgoodeffectofpreventingtealeavespotdiseases.Thefermentationconditions,processingtechnique,accessoryingredientandcontrol

4、effectagainstleavespotdiseasesinfieldofthisstrainweretested.Theresultindicatedthatitsoptimumconditionsofproducingantimicrobialproteinshouldbenitrogensource(peptone),cultivationtemperature(35*C),carbonsource(sucrose),cultivationtime(72h),originalpH6.6andliquidmediumvolume(50ml/250ml).Itsoptimumcondit

5、ionsofsolidstatefermentationwastestedtobenitrogensource(defattedsoybean),carbonsource(bran),moisturecontent(25ml/250ml),inoculumconcentration(4%),cultivationtemperature(35C)andoriginalpH6.6.Fourkindsofaccessoryingredient(calciumcarbonate,kaoline,talcumpowderandkieselguhr),onekindofwettingdispersants

6、(calciumlignosulphonate)andtwokindsofprotectiveagentfromUV(humicacidanddextrine),werescreened.Themicrobialinoculum(wettablepowder)wastestedtohavegoodeflectofpreventingtealeavespotdiseases(70%)inteagarden,whichwasappropriatetotheelfeetofSanmateasacontrol.Keywords：biocontrolbacteria,Bacillussubtilisle

7、avespotdiseaseoftea,microbialinoculum,effectofpreventingdisease0引言茶叶是以嫩梢为主要收获物的经济作物,病虫害的发生和危害对茶叶的生产和加工造成了许多不良的影响七目前，生产上应用的一些生防菌剂主要是从土壤或作物根际筛选获得，这些产品存在生产难度大、定殖能力差、易产生抗性而退化、田间应用受气候条件影响等缺点很多茶园管理者对微生物农药缺乏全面的认识，对微生物农药信心不足，微生物农基金项目：国家自然科学基金资助项目“杀虫防病1：程内生细偏植物疫苗研究M（No.30370968）.第一作者简介：洪永聪，男，1977年出生,博士，讲师，研究

8、方向：生物防治.通信地址：266109山东省青岛市城阳区长城路700弓，青岛农业大学生命科学学院.Tel:053288030231.E-mail:hongyongcong.收稿日期：2009-04-30,修回日期：200995-2】药的推广使用需要大量的技术指导并加强宣传力度叫针对当前茶树病害生物防治的研究现状及茶叶农药残留情况,在从茶树叶片上分离筛选到一株能在茶树体内内生定殖、对茶叶斑病防病效果好的枯草芽苑杆Bacillussublilis）菌株TL2同的基础上，笔者拟优化该生防菌株的发酵条件和生产工艺，并且筛选适宜的助剂，为生防茜剂的工业发酵生产提供理论依据，测定该生防菌剂在大田对茶叶斑病

9、的防病效果，为生防菌剂的实际开发利用打下基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1供试菌株枯草芽泡杆菌（BacillussubtUisY株TL2,经鉴定能在茶树体内内生定殖、对茶叶斑病有较好防治效果。茶轮斑病菌（PesiQllozzia血ae）,由该课题组分离、鉴定和保存。1.1.2培养基内生细凿的生长培养基为NA或LB,分离培养基为NA。病原真菌的生长培养基为改良PDA,产弛培养基为燕麦培养基。内生细菌的拮抗性测定培养基为PDA。1.1.3大田试验地点分别在青岛农业大学校内茶园、日照凯越茶厂茶园、崂山沙子口茶园等地进行。1.2菌株TL2液态发酵条件的优化采用L25（56）正交表（如表1）,测

10、定碳源（含最为1%）、氮源（含品:为0.3%）、培养温度、培养时间、初始pH以及装液量（250ml三角瓶）等6种因素对菌株TL2产生抗菌蛋白的影响，每种因素各取5个水平。对峙生长法测定不同处理发酵液的抗菌活性，根据结果计算出每个处理对茶轮斑病菌丝生长的抑制率（%），从而优化出菌株TL2的最佳产肮条件。表1菌株TL2产肮条件优化的正交设计方案因素碳源氮源培养温度/*c培养时间/h初始pH250ml装液量/ml水平1匍萄糖硫酸铉20126.225水平2果精蛋白腺25246.650水平3庶糖胰蛋白腺3048775水平4麦芽糖酪蛋白35727.4100水平5淀粉尿素40967.8150表2菌株TL2固

11、态发醵工艺优化的正交设计方案因素碳源氢源含水tf/ml接种量/（V/m）培养温度/*C初始pH水平1稻谷壳硫酸铉151%206.2水平2米淼尿素202%256.6水平3玉米粉花生饼粉253%307水平4荻皮豆饼粉304%357.4水平5棉籽壳鱼粉355%407.81.3菌株TL2固态发酵工艺的优化采用L25（56）正交表（如表2）,测定碳源、氮源、含水域（250ml.三角瓶）、接种量（V/m）、培养温度以及初始pH等6种因素对菌株TL2活菌数的影响，每种因素各取5个水平。根据配方称取固体发酵培养基原料（其中碳源和氮源的总质量为20g）,加入自来水挽拌均匀，以“手握指缝有游离水，但滴不下来”为标

12、准。搅匀后的固态培养基转入到250mL三角瓶中，培养基经121-C灭菌30mino降温后接种入种子菌，置37.C培养箱中静止培养，间时拍打，使其均匀生长，培养48L于60.C烘干、粉碎、平板菌落技术法测定不同处理的活菌数（亿个龟）。1.4菌株TL2的助剂伟选设计单因素试验（因素水平如表3）,测定载体、润湿分散剂以及保护剂等3个因素对菌株TL2拖子粉的影响。将新鲜抱子粉与各种载体、各种润湿分散剂和各种保护剂分别按1：10、5：1和50：1的比例混合均匀，对照为不加助剂的新鲜抱子粉。室温放置2天后，称取1g的混合物，平板菌落技术法测定不同处理的活菌数（亿个/g）。以上每个处理设3次重复。数据分析利

13、用统计软件SPSS13.0进行，采用LSD法对进行方差齐性检验，比较同因素不同处理之间及与对照的差异显著性,数值采用平均值标准误差。1.5生防菌剂的大田防治试验在茶叶斑病发病初期，在3个大田地点分别设置生防区、药剂对照区和空白对照区3个处理，每区大小为0.13.20hm生防菌菌剂以1000倍兑水稀释喷雾，对照药剂多菌灵按500倍兑水稀释喷雾。喷施表3菌株TL2弛子粉助剂筛选的单因素试验设计方案水平我体润湿分散剂保护剂1碳酸钙十二烷基硫酸钠（SDS）甲基纤维素2高岭土净洗剂（LS）腐植酸3白炭黑十二烷基苯硕酸钠（ABS）糊精4滑石粉木质素横酸钙荧光素钠5硅藻上二丁基蔡横酸钠（BX）黄原胶6皂土木

14、质素横酸钠CMC-Na时间选在下午45时进行，应保证喷后24h无雨，否则试验应视为无效。试验均在同等茶园正常的肥水管理下进行，田间最高温度在2533C间。在综防区内禁用其它任何土壤杀细菌剂。综防区统一于对照发病盛期，按茶叶斑病调查的行业标准进行抽样调查，需同时调查全部的对照及化学药剂对照，生防区的调查面积不得少于对照区。调查时，以发病率进行调查统计，计算病情指数以及防治效果（）。2结果与分析2.1菌株TL2的液态发酵条件菌株TL2对茶轮斑病抑菌率的正交统计结果（表4）表明：试验的6种因素中极差A值从大到小依次为，氯源（39.8）、培养温度（34.3）、碳源（32.8）、培养时间（30.1）、p

15、H26.9和装液量（12.3）,这一结果说明影响菌株TL2抗菌蛋白产量的因素作用大小依次为：氮源、培养温度、碳源、培养时间、pH值和装液量从各水平的统计A值比较来看，菌株TL2的最佳产酶条件应为：氮源（蛋白豚）、培养温度（35C）、碳源（蔗糖）、培养时间（72h）.pH6.6和250ml装液量（50ml）。2.2菌株TL2的固态发酵工艺菌株TL2活菌数的正交统计分析结果（表5）表明：试验的6种因素中极差&值从大到小依次为：氮源（133.74）、碳源（34.74）、含水量（33.40）、接种量（30.62）、培养温度（24.08）和初始pHO.2258。因此，影响菌株TL2固态发酵工艺的因素作用

16、由大到小依次为：氮源、碳源、含水量、接种量、培养温度和初始pHo从各水平的统计A值比较来看，菌株TL2的最佳固态发酵工艺应为：氮源（豆饼粉）、碳源（缺皮）、含水量（25ml）、接种最（4%）、培养温度（35C）和初始pH7.0o表4菌株TL2抑菌率（%）的正交统计结果因素碳源氯源培养温度/C培芥时间/b初始pH250ml装液址/ml水平1葡萄挺硫酸铉20126.225水平2果糖蛋白腺25246.650水平3蔗糖胰蛋白豚3048775水平4麦芽精酩法白35727.4100水平5淀粉尿素40967.8150A154.027.038.143.632.846.7A246.566.735.133.059

17、.654.2A367.853.935.149.555.850.8A439.256.969.563.144.548.8A535.038.064.653.149.841.9极差R32.839.834.330.126.912.32.3菌株TL2的助剂筛选不同助剂对菌株TL2弛子粉活力影响的方差齐性检验结果（表6）显示：皂土、白炭黑与对照存在显著性差异,特别是白炭黑的弛子粉活菌数明显低于对照，说明其对弛子活力的伤害较大；而碳酸钙、高岭土、滑石粉和硅藻土等4种处理的活菌数与对照没有显著性的差异，可以考虑作为制剂的载体。十二烷基硫酸钠、净洗剂、十二烷基苯磺酸钠、二丁基荼磺酸钠和木质素磺酸钠等5种润湿分散剂

18、的处理，活薄数与对照存在显著性差异，说明它们对勉子活力都有可能造成伤害；而木质素磺酸钙处理后的活菌数与对照没有显著差异，对勉子活力无明显的影响，可以考虑作为制剂的润湿分散剂。在紫外照射下，甲基纤维素、荧光素钠、黄原胶和CMC-Na等4种保护剂对抱子活表5菌株TL2,固体发酵活菌数（亿个/g）的正交统计分析因素碳源敏源含水量:/ml接种e/V/m)培养温度/C初始pH水平1稻谷光硫酸铉15!%206.2水平2米糠尿素202%256.6水平3玉米粉花生饼粉253%307水平4缺皮豆饼粉304%357.4水平5棉籽壳鱼粉355%407.8A185.1618.42118.9692.5495.38116

19、.62A2108.501)7.1689.0296.76110.6694.78A3106.30126.28122.42120.78111.26117.36A4119.90152.16101.82123.16119.46103.72A5115.60121.44103.24102.2298.70102.98极是R34.74133.7433.4030.6224.0822.58表6不同助剂对菌株TL2弛子粉活菌数（亿个/g）的影响水平载体润湿分散刑保护剂165.84.4a33.8士10.5c86.7】.0b26L65.8a51.8*3.5be106.314.0a335.5M.4b5O.35.ObH8.(

20、H：18.7a48l.912.4a67.63.9a77.04.6c576.29.1a31.02.0c90.79.3b651.85.2b51.36.5be79.3l3.7bcCK80.35.4a70.73.6aH0.0ti3.1a表7三试点两年示范推广生防菌剂对茶叶班病的防治效果姓理青岛农业大学校内茶园日照凯越茶厂茶园崂山沙子口茶园病情指数防治效果/%病情指数防治效果/%病情指数防治效果/%生防区6.383.27.9739.971.1药剂对照区5.984.21162.56.880.1空白对照区37.5/29.3/34.2/力影响与对照呈现显著差异；而腐植酸和糊精处理的活菌数与对照无显著差异，说明

21、它有效地保护弛子免受紫外光的伤害，可以考虐选用它们作为制剂的紫外保护剂。2.4菌株TL2对茶叶斑病的大田防治效果在青岛农业大学校内茶园、日照凯越茶厂茶园、崂山沙子口茶园等地利用生防菌剂对茶叶斑病进行了大田防治试验，结果（表7）表明：生防菌剂对茶叶斑病有较好的防治效果，防效达70%以上，与对照药剂多菌灵的防治效果相当。3小结与讨论通过液体发酵条件优化，得出生防菌的最佳产肮条件为氮源（蛋白豚）、培养温度（35C）、碳源（蔗糖）、培养时间（72h）、pH6.6和250ml装液量（50ml）。通过固态发酵工艺优化，得出生防留的最佳固态发酵工艺应为:氮源（豆饼粉）、碳源（荻皮）、含水量（25ml）、接种量（4%）、培养温度（35C）和初始pH7.0。通过助剂筛选，得到生防菌制剂的4种良好载体，碳酸钙、高岭土、滑石粉和硅藻七等，1种良好的润湿分散剂，木质素磺酸钙，以及2种优良的紫外保护剂，腐植酸和糊精。生防菌剂的大田试验表明，抱子粉可湿性粉剂对茶叶斑病有较好的防治效果，防效达70%以上,与对照药剂多菌灵的防治效果相当。进一步加强与生物农药企业的开发