猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组结构及疫苗研究进展.docx

1、猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组结构及疫苗研究进展刘德成（辽宁职业学院，辽宁铁岭112000）摘要：猪繁殖与呼吸综合征是一种引起母猪繁殖障碍及新生仔猪呼吸道症状和高死亡率的传染病，其病原猪繁殖与呼吸综合征病毒是RNA病毒，各国相继发生流行姓感染，给养猪业造成严重的经济损失。本丈旨对猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组结构及疫苗研究进展予以综述，为进一步研究提供材料。关键词：猪；繁殖；基因；疫苗中图分类号S856.3文献标识码A文章编号1004-6704（2012）04-0061-04ProgressonPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeViralGenome

2、andVaccineLIUDe-chengLiaoningVocationalCollege,TitlingLiaoning112000«China")Abstract:Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)isakindofinfectiousdiseasewhichcancausereproductivedifficultyofsowsandrespiratorytractsymptomandhighmortalityofpiglets,thevirusofinfectedporcinebelongstoRNAvi

3、rus.Epidemicinfectionwasoccurredconsequentlyinalotofcountriesandcausedheavyeconomiclossforswineindustry.ThisarticleaimedtooverviewprogressofPRRSviralgenomeandvaccineandinordertoprovidematerialsforfurtherstudy.Keywords：swine；reproductiongenetvaccine猪繁殖与呼吸综合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,

4、PRRS），俗称"猪蓝耳病"，是一种引起母猪繁殖障碍及新生仔猪呼吸道症状和高死亡率的新RNA病毒传染病。其病原猪繁殖与呼吸综合征病毒最早与1987年发现于美国，1991年荷兰人Wensvoot等首次从发病仔猪和母猪体内分离到了该病毒，当时称为Lelystad病毒（LV）。随后德国、美国、英国等也分离到了该病毒，目前，该病已遍及北美洲及欧洲，在全球范围内传播，亚太地区也呈蔓延之势，日本、韩国、菲律宾及我国台湾等均有疫情报道。郭宝清等1996首次从国内疑似PRRS感染猪群中分离出PRRSV从而证实了本病在我国的存在。近年来各地相继发生流行性感染，给养猪业造成的经济损失严重。1基

5、因组结构PRRSV基因组全长约15kb,为不分节段、聚腺收稿日期2012-00-00基金项目江宁省教育厅科研项目（L2O1O341）作者简介刘德成（1979），男.吉林人，讲师，兽医师，项士，从事教学与研究工作.昔酸化的单股、正链RNA病毒。包括9个开放性阅读框架（ORFs）,即CRFla、ORFlb、ORF2a、ORF2b、（）RF3、（）RF4、ORF5、ORF6和（）RF7,病毒基因组的各读码框都和其相邻的读码框有部分重叠。1.1 PRRSV的结构蛋白ORF27编码PPRSV的结构蛋白，这些蛋白都含有糖基化位点及C端和N端疏水序列。其中ORF2ORF4分别编码GP2、GP3、GP4三种糖

6、基化蛋白，ORF5ORF7分别编码囊膜蛋白GP5（也称E蛋白）、基质蛋白M和核衣壳蛋白N。1.2 GP2蛋白GP2蛋白是由ORF2编码的N-端糖基化蛋白质，分子量为2930KDa,具有两个明显的疏水峰和两个糖基化位点。GP2蛋白免疫原性较差，在病毒中含量很少，不易从感染的细胞裂解液和纯化的病毒粒子中分离得到。目前有关GP2的研究还比较少，其详细生物学特性和功能还不是很清楚。1.3 GP3蛋白GP3蛋白由ORF3编码，其内含265个氨基酸，分子量为4550KDa,是一个与非病毒相关性的高度可溶性蛋白，具有7个糖基化位点。GP3是PRRSV各毒株间保守性最差的蛋白，在欧洲型和美洲型毒株间推导氨基酸

7、的同源率为54%60%,并且变异多发生在C末端。欧洲株的GP3蛋白在C端比美洲株多12个氨基酸，所以二者的C末端性质不同。但是现在还不清楚这种不一致是否导致其功能上的差异。Meulenberg等对欧洲型毒株的研究表明，GP3是结构蛋白，但Gonin的研究却认为，GP3是一种非结构蛋白。而目前认为其是PRRSV的结构蛋白之一。Duran等利用杆状病毒表达载体表达PRRSVGP3蛋白，其表达产物可给母猪提供68.4%的保护率，这充分说明GP3蛋白表达产物在抵抗病毒感染时具有一定作用。1.4 GP4S白GP4蛋白是由ORF4编码的一种糖基化囊膜蛋白，其分子量为3135kDa,具有4个糖基化位点，C一

8、末端有引起病毒粘附的跨膜区域，且N端和C端是高度的疏水区。此外，GP4蛋白氨基端有一信号肽序列，其胞外区第4079位氨基酸之间有一个能与单抗发生中和反应的抗原决定簇，且这一区域在不同的病毒中高度可变，这可能与免疫选择有关。已有研究表明，GP4至少含1个线性优势免疫决定簇，它的单抗具有中和作用，推测这个蛋白至少有部分暴露在PRRSV粒子的表面。Weiland等认为，抗PRRSVGP4单克隆抗体与正常猪细胞的高尔基体能够发生交叉反应，说明自身免疫反应可能在PRRSV感染机体过程中起到一定作用。目前，有关PRRSV感染后GP4蛋白是否产生中和抗体这一问题存在一定的争议，本试验将对其作进一步说明。1.

9、5 GP5蛋白GP5蛋白又称E蛋白，由ORF5编码，囊膜糖基化蛋白，分子量为24.526kDa,LV毒株的GP5含有24个糖基化位点，201个氨基酸；而VR-2332毒株有4个糖基化位点，200个氨基酸。位于GP5N末端第28201位碱基处含有31个氨基酸的信号肽序列。此蛋白内部有一段很大的疏水区，有学者认为这可能对锚定膜起到一定的作用。GP5是PRRSV结构蛋白不同分离株间变异率最大的，然而在这一疏水区序列却表现的相当保守。Olesiewicz等研究表明GP5蛋白具有6个抗原决定簇，其中有一个能诱导机体产生特异性中和抗体的特异的线性决定簇，可以在体外中和PRRSV的感染。也有研究表明，PRR

10、SV中和作用与抗GP5抗体效价相关性显著，并且在中和病毒方面，针对GP5的单抗比GP4的单抗更为有效可靠。过去学者普遍认为抗体对PRRSV特异性免疫是无效的、有害的，但LopezOJ等研究证明中和抗体在抗PRRSV感染的保护性免疫中扮演着重要的角色。本试验也对PRRSVGP5蛋白的中和作用进行了探讨。1.6 M蛋白M蛋白是由ORF6编码的非糖基化的膜蛋白，分子量1819kDa,PRRSV结构蛋白中最保守的蛋白，不同分离株同源性在99%以上。美洲和欧洲型分离株分别含有174和173个氨基酸。M蛋白具有一个糖基化位点，由于该位点不与寡聚糖相结合，用内切糖基化酶消化后，其分子量并不减少，从而说明M蛋

11、白是一种非糖基化蛋白。在其N端有3个高度疏水疏水性跨膜区。M蛋白上有中和性抗原表位，但中和滴度较低。免疫原性较强，感染后10夭便可以产生可检测到的抗体应答，体外表达的重组M蛋白可以作为血清学试验的靶抗原，但对PRRSV没有中和作用。L.Yang等首次证明利用M蛋白诱导产生的抗体与先前报道的GP3、GP4、GP5蛋白诱导产生的抗体一样具有中和作用。1.7 N蛋白N蛋白是由ORF7编码的核衣壳蛋白，分子址为1445kDa,美洲和欧洲型分离株分别含有123和128个氨基酸。N蛋白的分子虽然较小.在该蛋白中至少鉴定出5个抗原决定簇。有报道认为C-末端对这些抗原决定簇的形成至关重要。目前对单克隆抗体的研

12、究发现.已制备的单克隆抗体绝大多数是针对该蛋白的不同抗原表位的，单克隆抗体中和试验结果表明，针对N蛋白的单克隆抗体无中和作用，不能给动物提供保护，但N蛋白是体液免疫应答的主要抗原，是当前PRRS血清学诊断方法的抗原基础，也是PRRSV抗原分型和基因分型的主要依据。2PRRS疫苗研究现状目前，用于预防本病的疫苗主要是常规疫苗，即灭活苗和弱毒苗，他们在控制PRRSV传播和蔓延上发挥了巨大作用。随着分子生物学的发展，研制安全、经济、有效、使用方便的新型疫苗已成为世界各国兽医研究领域关注热点。2.1PRRS灭活苗灭活疫苗(inactivatedvaccine)是将致病性病原体大量培养后，经灭活处理，使

13、其失去感染性但保留免疫原性而制得的一种传统的疫苗。PRRS灭活疫苗具有安全、不存在散布病毒和造成PRRS新疫源的危险，对母源抗体的干扰作用不敏感，便于贮存和运输、不能返祖返强等优点，被作为预防和控制PRRS的首选疫苗。目前，PRRS灭活苗主要用于预防后备母猪和妊娠母猪感染PRRSV所造成的繁殖障碍，不适合仔猪免疫。所以，仅依靠灭活苗免疫猪体以建立牢固的免疫力是不够的，迫切需要更加安全、有效的疫苗来预防和控制PRRS的发生与流行。2.2 PRRS减毒活疫苗1995年，美国BochfingerInglehcim公司首次推出商品化减毒疫苗RespPRRS/ReproTM,并获准用于318周龄猪的预防

14、接种，一些国家还将其用于繁殖猪群免疫;ScheringPlough动物保健公司生产的弱毒疫苗PrimePacRPRRS,用于母猪配种前36周的预防接种，但严禁用于PRRS阴性猪群、妊娠母猪和育龄猪。何信群等制备了PRRSV减毒活疫苗，并进行了猪体试验，结果证明免疫后2035天表现出抗体高峰，且可持续3个月以上，有较长的免疫保护期，免疫后第14天便可检测出PRRSV中和抗体。Mengeling等发现用PRRSV弱毒株免疫猪可对猪体产生较高水平的免疫保护，但免疫后猪的淋巴结呈现肿大。Labarque等表明PRRSV弱毒疫苗的保护效力不完全。Dewey等认为，母猪妊娠期间的任意时间免疫PRRS减毒活

15、疫苗都会导致产活仔数虽减少，死胎及木乃伊胎增多，尤其是妊娠的最后4周免疫影响最大，母猪免疫应在未妊娠的时候进行。Mortensen等研究报道，用PRRS弱毒苗接种母猪后，会对母猪的繁殖性能造成不利影响，甚至可通过子宫感染胎猪。可见，PRRS减毒活疫苗免疫怀孕母猪后会产生一些副作用。与灭活苗相比，减毒苗诱导的免疫反应持续的时间更长，效果更加明显。但弱毒苗的安全性和效力并不可靠，且能阻止病毒的二次感染。2.3 PRRS亚单位疫苗基因工程亚单位疫苗(subunitvaccine)也称生物合成亚单位疫苗或重组亚单位疫苗，用这类疫苗接种动物，可使病猪获得保护性抗体，从而免受病原体的感染。亚单位疫苗安全，

16、无须灭活，也没有致病性。但由于它不能在体内复制，因此所需的量较大，成本也随之提高，从而限制了亚单位疫苗的广泛应用。2.4 PRRS核酸疫苗核酸疫苗又称DNA疫苗或基因疫苗，是利用基因重组技术将编码抗原蛋白的外源基因插入真核表达载体，直接接种到患病动物体内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，并能够诱导宿主产生对该蛋白的免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。与传统疫苗相比，核酸疫苗具备亚单位疫苗和灭活苗的安全性，具减毒疫苗和重组疫苗的免疫应答的特点。Pirzadeh等制备了针对PRRSVGP5蛋白的核酸疫苗，通过小鼠和猪体免疫试验均证实了核酸疫苗诱导产生了病毒特异性的体液免疫和细胞免疫。但关于

17、核酸疫苗的效力、注射方法、大规模生产及经济效益等方面仍存在较多问题，所以目前动物核酸疫苗也括PRRSV核酸疫苗离实际应用还有很长一段路要走。2.5PRRS活病毒载体疫苗活病毒载体疫苗就是利用基因重组技术将异源性病毒的保护抗原基因和启动子调控序列插入到减毒的病毒载体基因组的某一特定部位，令其高效表达，促使免疫动物产生抗体和细胞免疫应答，从而获得对插入基因相关疾病的抵抗力。活载体疫苗克服了常规疫苗的缺点，兼有灭活疫苗和活疫苗的优势，与核酸疫苗相比，活载体疫苗能主动感染宿主细胞，外源基因进入细胞的效率大大提高；载体自身带有佐剂效应，能够诱导细胞因子和趋化因子的产生，并能诱导长期的免疫应答。PRRS的

18、活载体疫苗主要有以腺病毒和伪狂犬病病毒等作为载体来表达PRRSV的主要免疫原基因，活载体疫苗现已成为PRRS疫苗的研究热点。到目前为止，国内外仍未找到治疗PRRSV感染的有效方法；现有的疫苗也不能达到理想的效果。应对PRRSV的预防与控制仍是世界各国所面临的难题。而今采取的主要对策是：加强饲养管理.降低饲养密度，实行严格的全进全出制，减少环境应激因素，实施严格的生物安全措施，严格防疫，定期消毒，对早期发现的疑似PRRSV感染猪进行检查、隔离、淘汰，建立健康猪群，以减少对养猪业的威胁。参考文献：1 殷震，刘景华.动物病毒学M.北京：科学出版社，1997,第二版：325-331,341-348,4

19、20-428,787-788.2 TcrpstraU,WensvoortG»PolG.Experimentalreproductionofporcineepidemicabortionandrespiratorysyndrome(mysteryswinedisease)byinfectionwithlelystadvirus：Koch'spostulatefulfilledJ.VetQ,1991,13(2):131-136.3 WuWH,FangY,FarwelR,etal.A10kustructuralproteinofporcinereproductiveandrespi

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