生物反应器培养轮状病毒基因重配株Ls条件的优化.docx

1、.论著.生物反应器培养轮状病毒基因重配株Ls条件的优化范秀娟，孙燕，孙振鹏，马超，孟子新，李欢，李薮兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃兰州730046摘要：目的轮状病毒基因重配株Ls(；3型)在生物反应器微载体培养Vero细胞条件的优化。方法采用3L生物反应器微载体培养Vero细胞，观察Ls株在不同病毒感染复数(0.001.0.002,0.010,0.040MOI)、不同温度(34.5T和35.5T)、不同病毒收获时间(24和48h)对病毒增殖的影响。根据病毒滴度和收获量筛选出最适M01、培养温度及病毒的收获时间。结果以0.0()2MOI接种Vcro细胞，温度为34

2、.5t培养病毒，滴度最高达7.50lgCCID/mL；48h可连续收获4次病毒液，且收获总量及病毒滴度均高于24h。结论通过对Ls株在生物反应器微载体Ver。细胞培养条件的优化，获得的病毒液滴度高及连续培养多次收获量增加的有效方法，为进一步规模化培养奠定了基础。关键词：生物反应器;轮状病毒基因重配株Ls；Vero细胞;培养;优化中图分类号：R373.2文献标志码：A文章编号：1005-5673(2015)06-0018-04DOI：10.13309/ki.prni.2015.06.005Optimizationoftechnologicalprocedureonthereassortantro

3、tavirusesstrainLscultivationinbioreactorFANXiu-juun,SUNYan,SUNZhen-pen,MAChao,MENGZi-xin,LIhuan,LIweiLanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.Ud,CenterforGtinsuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthor:UWei,E-mail:jjfsyyAbstract:ObjectiveTooptimizethekey

4、conditionforcultureofrotavirusreassortantstrainLs(Type4)byusingverocellsadsorptcdonmicrocarriersculturedinbioreactor.MethodsTheeffecttomultiplicationoftheviruswasinvestigated,Verocellsculturedin3Lbioreactorascellmatrix,theninoculateclwithLsstrainatMOIsof0.001,0.002,0.()10and0.040,indifferenttemperat

5、ures(34.5X.or35.5°C)anddifferentharvestintervals(24hor48h),onwhichtheoptimalMOI,temperatureandhavestintenalweredecided.ResultsUndertheconditionof0.002MOI,34.5°C,廉wasculturedwellwithatiterupto7.50IgCCID/mL,andacontinuousfourharvestsobtainedin48h,andthetotalharvestandthevimstiterswerehighert

6、hanculturedin24h.ConclusionAneffectivemethod(orincreasingrotavirustiterwasdevel-opedbyoptimizingtheconditionforcultureofIdonVerocellsinbiorector,onwhichthefoundationwasdevelopedinalargescalepreparationofrotavirusvaccine,live.Keywords：Bioreactor；ReassortantrotavirusesstrainLs;Verocell；Culture;Oplirni

7、zalion轮状病毒(Rwau，n«,RV)是5岁以下儿童严重脱水性腹泻的主要病因。2008年，世界卫生组织(WHO)估计全世界因轮状病毒胃肠炎(Roiavirusgastroenteritis,RVGE)引起的儿童死亡约45.3万,占全世界所有儿童死亡数的5%；研究表明轮状病毒疫苗可明显降低RVGE的发生率、住院率及病作者简介：范秀婿，医学生物学工程师.主要从事病毒性疫苗的研发。通讯作者：李穗，E-mai】：jjfsyy死率。因此，安全、有效的轮状病毒减毒活疫苗已成为预防轮状病毒感染性腹泻的最有效的手段RV常见的血清型是G1G4型，中国主要以G1、G3型为主,2001年以后则以G3

8、型为主。轮状病毒基因重配株I虱以下简称为1=株)是以目前在中国上市销售的疫苗株LLR(羊)和G3型人轮状病毒SA-H株为亲本,经体外基因重配获得，其既有动物RV的安全性乂有人的免疫原性，能特异有效的预防人体RV感染，可优选作为疫苗的候选毒株。生物反应器微载体培养是贴壁依赖型细胞大规模培养的主要方法，目前已有多种利用微栽体培养技术生产的疫苗销售。实验中优化生物反应器微载体Vero细胞培养Ls株的关键条件，为进一步规模化生产提供了数据支持。1材料与方法1细胞和病毒株Vero细胞购自美国ATCC(CCL-81,120代)，由兰州生物制品研究所有限责任公司第六研究室传代保存,代次为134代；MA-10

9、4细胞及轮状病毒基因重配株株由兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室提供。1.2主要试剂及仪器新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司;DMEM培养基购白杭州宜星塞尔生物科技有限公司；微载体Cytodexl购口GE公司;3L生物反应器购自荷兰APPLIKON公司；T-Oask细胞培养瓶购自丹麦NUNC公司；胰蛋白前购自美国GIBCO公司；人轮状病毒抗原EL1SA检测试剂盒由兰州生物制品研究所有限责任公司诊断用品室提供。1.3细胞培养1.3.1细胞传代按常规法将Vero细胞在T-flask细胞培养瓶中传代至140代备用。13.2生物反应器细胞培养将140代Vero细胞，制备为细胞密度2.OX1O

10、5个/mL,接种到每升含有4g微载体的3L生物反应器中，设定生物反应器培养细胞的条件为温度37T,溶氧40%,搅拌速率为18r/min,pH7.20。逐日换50%体积的细胞生长液(含5%牛血清DMEM),待培养至96h时，改用细胞维持液(含1胰蛋白酶的无血清DMEM培养液)培养，逐日显微镜下观察细胞生长状态，并取样检测细胞密度，绘制Vero细胞生长曲线。1.4病毒培养及收获1.4.1不同病毒感染复数对病毒增殖的影响将生物反应器内贴附微载体的单层Vero细胞,用细胞维持液洗涤3次；分别以0.001A002、0.010、0.040MOI接种Ls株,加入细胞维持液至工作体积，在温度34.5T,溶氧2

11、0%,搅拌速度为20r/min,PH7.40条件下进行培养。逐日观察细胞病变(CPE),并取样检测病毒滴度，绘制病毒增殖曲线,确定最适病毒感染剂量。1.4.2温度对病毒增殖的影响其他培养条件同1.4.1项，按1.4.1项所述方法筛选出的MOI接种Ls株，分别在34.5二和35.5丁两种温度进行培养。逐日观察CPE,并取样检测病毒滴度，确定Ls株的最适培养温度。14.3病毒收获时间按1.4.1项方法将筛选出的MOI接种Ls株，并在34.5°C条件下培养，于24h和48h分别连续收获病毒培养液，并补加新的细胞维持液继续培养。逐日观察其CPE及进行多次收液，并检测收获液病毒滴度,根据病毒滴

12、度和收获液总量筛选出最适病毒收获时间。1.5病毒滴度的测定采用细胞微量病变滴定(CCIDQ结合酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定病毒滴度。将MA-104细胞接种于96孔细胞培养板中，置37丁培养箱内培养;将待检样品10倍系列稀释,每个稀释度平行接种4孔，每孔100心,以培养液作为空白对照，置37T,5%CO?培养箱中培养46d°逐日观察,至出现CPE为止，冻融2次，每孔吸取培养物50jjlL,用轮状病毒ELISA试剂盒进行检测，以Karber法计算相应的IgCCID/mL值。2结果2.1Vero细胞生长曲线Vero细胞接种至生物反应器的微载体后,第2天细胞在微载体上生长缓慢；从第3

13、天开始细胞进入对数生长期；至第5天时进入平台期，细胞密度为2.8xl()6个/mL。换无血清DMEM维持液培养后，每天取细胞样品计数，第14天时细胞密度仍维持在2.68X106个/mL,见图lo图1生物反应器培养Vero细胞生长曲线Fig.1KineticcurveforVerocellculuredin3Lbiorcactor(Cytodexl)2.2病毒感染剂量的优化由图2所示可见，MOI的剂量越大,Vero细胞出现的病变越早，细胞维持的时间相应越短。当I与株接种剂量为0.04M0I时,24hVero细胞出现病变,72h病毒滴度达到峰值7.00lgCClD5O/mL,96h细胞从微载体表面

14、几乎全部脱落；接种剂量为0.01MO1时，72h病毒滴度达图2不同MOI感染Vero细胞的病毒增殖曲线Fig.2ProliferationcurveforrotavirusproliferationinVerocellsinoculatedatvariousMOIs到峰值为7.50IgCCID/mLdh病毒滴度下降至5.75IgCCID/mL,120h细胞从微载体表面脱落;当病毒接种剂量为0.0020.001M0I时,48h细胞出现病变,96h病毒滴度达到峰值，分别为7.50IgCCID/mL和6.75IgCCID/mLUOh细胞脱落。表明病毒接种剂量为0.002M0I时、病毒收获液滴度最高值

15、可达7.50IgCCID/mL,且持续时间较长。1. 3温度对Ls株在Vero细胞上增殖的影响由表1所列可见，当培养温度为35.5Y时,24h收获液病毒滴度为6.50lgCCID50/mL；48h为6.75IgC-CID50/mL,72h细胞从微载体表面脱落而停止培养，收获液病毒滴度为6.75lgCCID50/mLo培养温度为34.5T时,48h病毒滴度为6.75lgCC!D50/mL,72h滴度增值为7.00lgCCID50/mL,96h滴度达高峰为7.50lgCClD50/mL,120h细胞从微载体表面脱落而停止培养，收获液病毒滴度下降至7.25lgCClD50/mLo实验表明，Ls株在培

16、养温度为T时病毒滴度和收获次数均优于培养温度35.5表1温度对病毒培养的影响Tab.1Effectoftemperatureonvirusculture培养温度（T）收获时间（h）病毒滴度（IgCCID/mL）486.7534.572967.007.501202435.548727.256.506.756.752.4病毒收获时间的优化由表2所列可见，每间隔24h收获病毒培养液,72h细胞从微载体表面几乎全部脱落，仅可收获3次;收获病毒液总量6L,病毒滴度最高达6.75IgCCID/mLo而每间隔48h收获病毒培养液，可实现4次收获,192h细胞才从微载体表面脱落，收获病毒液总量8L,病毒滴度最

17、高可达7.50IgCCIIZ/mL。病毒收获时间的优化，实验表明收获时间以48h为宜,可连续4次收获病毒液，且收获总量及病毒滴度均高于24h。表2不同间隔时间收获对病毒滴度的影响Tab.2Effectofvirustilersatdifferentharvestintervals收获间隔时间病毒滴度(IgCCIDjo/mL)(h)24487296120144168192246.006.756.25一486.007.507.507.25注:为未收获。3讨论目前常用的病毒性疫苗生产工艺多采用转瓶或细胞工厂，这些方法存在占用空间大、批间质量差异大、病毒收率较低等缺点，制约了疫苗规模化生产；规模化培养

18、病毒是现代生物技术制备疫苗发展的必然趋势。Vero细胞易于大规模培养，是WHO推荐使用的人用疫苗生产基质,被广泛应用于病毒性疫苗的生产。应用生物反应器微载体Vero细胞规模化生产疫苗，生产效率高，所需空间小，可大大降低劳动强度，改善工作环境，并提高了疫苗的产量和质埴。实验结果显示，不同M0I接种Vero细胞的病变程度及病毒收获液滴度存在差异。当M0I为0.002时，收获液的病毒滴度最高，为最适M0Io接种量低，不足以完全感染细胞;接种量过高，则会导致细胞迅速死亡，使病毒失去赖以生存的环境；只有适当的M0I、温度及培养时间等，才能高效地感染细胞且培养产生出较高滴度的病毒"。该病毒的收获

19、时间为48h时，并可连续收获数次、收获液总量及病毒滴度均高于24h。这可能是由于每间隔24h收获时，轮状病毒在Vero细胞内的增殖还尚未达到高峰。综上所述，实验中通过优化生物反应器微载体Vero细胞培养Ls株的增殖条件，确定以0.002M0I接种量、培养温度为34.5乞、病毒收获间隔时间为48h,得到的收获液总量最多、病毒滴度最高，为进一步规模化生产奠定了基础。参考文献'iWHO.RotavirusvaccinesWHOpositionpaper-January2013.WER,20】3,88(5)；49-64.2 LiRC,HuangT,LiY,al.Humanrotavirusva

20、ccine(RIX4414)efficacyinthefirsttwoyearsoflifeArandomized,double-blind,placebo-controlledtrialinChinaJ.HumVaccinImmunother,2014,10(1)：11-18.3 LatipovR,KuatbaevaA,KristiansenO,elal.Economicburdenofrotavirusdiseaseinchildrenunder5yearainKazakhstanJ.Vaccine,2011,29(24)：4l75-4180.4CorteseMM,ImmergluckLC

21、,HeldM,rta2.Effectivenessofm-onovalentandpentavalentrotavirusvaccineJ.Pediatrics,2013,132(l)：e25-e33.5张丽杰，方安.中国婴幼儿轮状病毒腹泻的流行病学和疾病负担研究进展J.中国计划免疫,2007,13(2):186-191.61夏德镇，杨志建，周正，等.生物反应器培养Vero细胞生产肠道病毒71型J.中国生物制品学杂志,2013,26(2):256-259.7WangI),XiaoC,ChenZ,etal.Studiesonhigh2densitycultivationofverocellswithbiosilonsolidmicrocanierJ.ChinJBio-technd,1996,12(2)：119-I29.8安红，张海红,王明强，等.细胞工厂培养轮状病毒基因重配株U(C3型)条件的优化研究J.微生物学免疫学进展,2014,42(1):25-30.收稿日期：2015-05-28修回日期：2015-07-20编辑:陈冬梅文摘乙肝表面抗原阳性产妇分娩的婴儿对乙肝疫苗的应答目的:在美国，每年有HBsAg阳性的产妇分娩约25000个新生儿。推荐新生儿出生时立即注射乙肝