禽源性大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法的建立与应用.docx

1、禽源性大肠杆菌HPI毒力岛基因PCR检测方法的建立与应用王艳萍I%董林二郭时金挪，徐倩倩7,3,莫玲I,王金良刘吉山、沈志强(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600;2.山东省滨州畜禽蜂胶疫苗研究开发推广中心，山东滨州256600；3.山东绿都安特动物药业有限公司，山东滨州256600)抻:摘要:为了解临床食源致病性大肠杆菌中高致病性毒力岛(HighpathogenicityislandHPI)流行情况和基因特征，根据:GmBank已知禽源砂基因序列，设计、合成一对特异性引物，建立irp2基因PCR检测方法，优化、确定PCR扩增特性，进行感性、特异性、重复性检测评价。对256份临床

2、分离禽源大肠杆菌进行诃2基因PCR检测和基因遗传变异分析。结果显':示，移立的PCR检测方法敏感性可达2.14x10"ng/皿;特异性显示与鸡沙门菌、副鸡嗜血杆菌、鸭疫里默菌、禽巴氏杆菌、贿琴支原体、鸡新城疫病毒、含流感病毒(H9N5)核酸均无交叉反应;重复性显示3份阳柱样品重复5次检测，变异系数3.4%5.0%。256份临床样品PCR检测邮基因，阳性率30.6%o获得了9株分离株祁2基因序列，分析显示，与GenBank已知基因同源性高达96.2%以上。说明建立的禽源大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法具有良好的特异性、枷性和重复性，可应用于临床致病性大肠杆菌毒力岛

3、基因快速检测。"如关词:食源大肠杆菌；HPI;毒力岛；打2基因文章分类号：S852.61*2文献标志码：A文章编号:0529-6005(2017)01-0086-04EstabUshmentandapplicationofPCRdetectionmethodforHPIirp2geneofavianEscherichiacoliWANGYan-ping1*23,DONGLin*,GUOShi-jin1*2,XUQian-qian123,MOLing*,WANGJin-liang1,LIUJi-shan,SHENZhi-qiang1(1.BinZhouanimalScienceandV

4、eterinaryMedicineinstitude,Binzhou256600,China；2.Shandong"tBinzhouResearchtdevelopmentandpromotioncenterforLivestockandpoultrypropolisvaccine,Binzhou256600,China；3.ShandongIvduanteAnimalMedicineCo.,Ltd,Binzhou256600,China)Abstract：HiepurposeofthispaperistoestablishthePCRdetectionmethodofirp2.To

5、understandtheclinicalpoultrypatho-.gameetcherichiacoliHighpathogenicityisland(HPI)prevalenceandgenetictraits,apairofspecificprimersweredesignedandsyn-tthesiaedaccordingtosequenceofirp2andthePCRdetectionmethodwasestablished,evaluationaboutoptimization,detenni-ningthePCRamplificationcharacteristics,se

6、nsitivity,specificityorandrepeatabilitywerestudied.Irp2genewasdetectedandgeneticvariationwasanalyedon256E.colistrainsisolatedfromclinicalavian.Resultsshowedthatthesensitivitywas2.14x104ng/皿：Specificitydisplayedthattherewasnocrossreactionbetweensalmonella,vicechickenhaemophilus,Riemerellaanatipestife

7、r,p6akiypasteurella,Mycoplasmagallisepticum,Newcastlediseasevirus,andavianinfluenzavirus(H9N5)；Repetitiveshowedthat,Mevariationcoefficientwas3.45.0%ifthreepositivesamplesrepeated5timestesting.Irp2genewasdetectedbyPCRfrom256oHnicalsamples,andpositiveratewas30.6%.Theanalysisof9strainirp2genesequencesr

8、evealedthatthehomologywasmorethan96.2%whencomparedwithGenbankknowngene.ThemethodofE.coliHPIirp2genePCRdetectionhasagoodspecificity,sensitivityandrepeatability,anditcanbeappliedtoclinicalgenerapiddetectionofHPI.Keywords：AvianEscherichiacoli；HPIpathogenicityisland；irp2geneCorrespondingauthor：SHENZhi-q

9、iang近年来畜禽大肠杆菌病严重影响着中国养禽收稿H期:2015-11-26基金项东省自然科学基金资助项目(ZR2014CQ012)作者简介:王艳淳(1979-)女，助理研究员，硕士.从事中兽药和畜禽细菌性疫病研究,E-mail:xiaowangjanping213通讯作者：沈志强，E-mail：1292986799®业的发展，虽然采取了强有力的防治措施，但由于大肠杆菌的变异性及耐药性日益增强，依然没有找到有效控制大肠杆菌病方法，于是专家们将焦点集中到了针对大肠杆菌的分子生物学研究上，期望通过对微观的研究发现一些解决问题的线索，其中大肠杆菌高致病性毒力岛(HPI)就是目前研究的重点之

10、一o1试验材料1.1菌株来源试验菌株：265株禽源大肠杆菌,分离自山东、江苏、河南、安徽、河北、辽宁等地；大肠杆菌。2标准株由安徽农业大学动物科技学院基础兽医学教研室馈赠。1.2 试剂与主要仪器pMD18-T、DL.2000DNAMarker.DL-15000Marker、DNA聚合酶、10xPCRBufferJNTP.g白酶K、琼脂糖等，购自宝生物工程（大连）有限公司;营养琼脂，购自北京奥博星生物技术有限责任公司;LP0021、LP0042,购自OXOIDLTD；细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）、多功能DNA纯化回收试剂盒（离心柱型），均购自北京百泰克生物技术有限公司。2试验方法2.1

11、引物设计与合成根据GenBank中已发表的禽源大肠杆菌高致病性毒力岛irP2基因序列，选取强保守性区段，设计如下特异性引物，用于切>2特异性序列PCR扩增，理论跨度约为521成。引物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。表1心引物设计名称序列起始位点片段长度PF-irp25-ATCGCTACCAGCCCTITG-3I542nt521ntPR-irp25-CTGTAGCGAGGCTTCTTC-32063nt2.2沐2基因PCR检测方法建立2.2.1大肠杆菌。2菌株基因组DNA制备挑取单个菌落，接种LB液体培养基，培养10h后,10000r/min离心2min收集菌体，提取细菌基因组D

12、NA,具体操作按北京百泰克生物技术有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。2.2.2 PCR扩增程序以制备的大肠杆菌O2DNA为模板，以PF-却2、PR-祁2为引物进行PCR扩增,PCR体系：10xPCRBuffer2.5|iL,dNTP2.0>iL,PF-irp2/PR-irp21.0piL,DNA模板4.0piL,ddH2O14.04T叫05皿,总体系25.0叫,确定最佳PCR程序。2.3PCR检测方法性能评价2.3.1敏感性检测将制备的大肠杆菌0?模板DNA进行10倍比系列稀释，测定各组份核酸含量，以不同稀释度DNA为模板进行irp2基因PCR扩增，检测其敏感性。2.3.2特

13、异性检测分别提取鸡沙门氏菌、副鸡嗜血杆菌、鸭疫里默菌、禽巴士杆菌、鸡毒支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒（H9N5）和禽源致病性大肠杆菌基因组DNA（其中新城疫和流感病毒提取RNA反转录成cDNA）。以制备的各类DNA为模板，进行irp2基因检测，评价建立的检测方法特异性。2.3.3重复性检测用3株已知£甲2阳性禽源致病性大肠杆菌,2株已知irp2阴性禽源大肠杆菌，提取细菌基因组，每一样品进行5次PCR检测，检测建立的检测方法重复性。2.4禽源大肠杆菌毒力岛却2基因检测应用建立的PCR方法对265例2014-2015年间来自辽宁、山东、江苏、河南、安徽、河北等地临床分离的禽源性大肠杆菌

14、进行中2毒力岛基因检测。检测病例病理剖检多表现为大肠杆菌病特征性病变，大肠杆菌性败血症表现为纤维素性心包炎，肝脏有白色被膜、有纤维素性附着物，有时有白色坏死性结节，脾脏肿胀、充血;卵黄性腹膜炎及输卵管炎、出血性肠炎,幼雏表现为脐带炎等，个别产蛋鸡症状不明显等等。2.5沏2毒力岛基因遗传特性分析回收PCR检测阳性样品DNA,连接pMD18-T,转化DH5a感受态细胞,筛选阳性克隆，提取质粒DNA,经PCR和酶切鉴定后，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。用Clustalx8.3、MEGA5.10软件进行基因同源性及遗传变异分析。3结果3.1irp2基因PCR扩增结果确定的PCR条件为：95X

15、.4min,94T1min,55T40s,72X.45s,30个循环,72Y10min,4Y终止。大肠杆菌0?标准株DNA为模板经PCR扩增后，产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，可看见大约521bp的特异性目的条带（图1）,与预期结果相符。回收PCR产物，经DNA序列测定分析，与已知的禽类大肠杆菌毒力基因irpl同源性在98.2%以上，说明建立的irp2基因PCR检测方法可特异性扩增目的irp2基因。3.2敏感性检测提取大肠杆菌O2DNA经10倍比稀释后取2.14x10'ng/|xL、2.14x10°ng/皿、2.14xl0_,ng/piL.2.14x10-2ng/»xL

16、、2.14x10-3ng/|xL、2.14x10-4ng/pX、2.14x10_5ng/jiL浓度DNA为模板进行PCR敏感性检测，结果显示，在2.14x10一4ng/jxL浓度以上检测目的条带清晰可见,2.14xIO、ng/皿浓度时检测条带出现模糊（图2），确定建立的PCR检测方法最高检测敏感性为2.14x1()*ng/p.L图1”庄基因PCR扩增结果图4重复性试验结果M：DNAMarkersDI.-2(XX)；I-5：R|性样品I;610：阳性M2；11-15：阳性样M3；16：阴性对照bp2000100075050025010013：肠钎倒标准株；4：性对照;M：I)NAMark

17、1;-rsl)l.-2(XX)13：肠钎倒标准株；4：性对照;M：I)NAMark«-rsl)l.-2(XX)20005212501001000750500bpM123456789图2PCR敏感性检测结果M：DXAlurkeiyI>1.-2(XX)；I8：2.14x10:.2.14xIO12.14xl()°、2.14xl"、2.14xIO'2.2.14x1()七2.14x10"*.2.14x105ng/|il.;9；阴性对照3.3特异性检测待异性检测结果显示.仅以禽致病性大肠杆菌基因组为模板的PCR扩增呈阳性,在约521l)p有特异性目的条

18、带，而以鸡沙门氏菌、副鸡嗜血杆慎、鸭疫里默菌、禽巴氏杆菌、鸡毒支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)核酸为模板,PCR扩增均无特异性条带出现，说明建立的检测方法待异性良好(图3)。图3PCR特异性检测结果M：l)NMarkeisI)1.-2(XX)；I；沙门氏削；2：副鸡嗜I。由信；3国疫果默|W：4：禽巴氏杵帽；5：鸡独支晓休：6：鸣新城疫利爆:7：肉流够桐排(H9、5)；8：阴性对照；9：肉致病性大肠杆倘3.4币：复性检测3份阳性样品、2份阴性样品分别重夏5次检测.PCR产物琼脂糖凝胶电泳后,3份阳性样品检测结果见图4,薄层灰度分析显示阳性样品变异系数在3.4%5.00,阴性样品5次

19、i(其均为阴性结果，说明建立的PCR检测方法站复性良好。3.5临床样品检测应用应用建立的PCR方法检测了临床病例,结果irP2RI性数81份.阳性率为3().6%.不同地域、不同宿主来源对毒力岛基因无明显区另I勿2阳性样品PCR产物.电泳检测均出现约521bp特异性11的条带(图5),说明建立的检测方法具有良好的临床实用性图5部分临床样品检测结果I-I2：|引性样品结果;13：阴性结果；14：HltHI照：IS：阳性对照:1：I)WMarkris1)1.-2(MX)3.6同源性分析茯得9株禽致病性大肠杆萌旋力岛irpl基因序列，经Clustalx8.3、MEGA5.1()软件进行基因同源性.结

20、果显示，其与GenBank中2知堆因同源性高达96.2%以上，显示其在遗传进化保守性较强遗传进化分析，显示不同分离株irP2基因。在差异性,分属不同基因分存，同源性fl'S的毒株间存在相似基因序列特征变异(图6)4讨论随若养殖方式和规模不断变化,细削性疾病,特别是由大肠杆禅病导致的损失.在禽类养殖中愈显币:要.同时，由于抗生索在芥殖中滥用致临床大肠杆幽变异性和耐药性日益增强，使得现右防控r-段和技术不能有效应对威胁因此，开展大肠杆菌相关毒力因*研究，从微观分子水平探索其致病机图6，碑基因遗传进化分析结果iq>2-3/4/6Z8/9/12/14/20/21标弓为自己分离株，力，2糖

21、因序列；其他标砂为(n-nBunk中已知序列理对临床大肠杆倘病的预防和治疗具有一定现实意义。大肠杆偏高致病性毒力岛(HP1)作为页要:致病因子，在E,coli致病过程中发挥作用。irP2作为铁调节.蛋白，是检测毒力岛的标志基因。本试骑针对毒力岛标志毒力因子诃，2在肉致病性大肠杆前中的基因分布特征和遗传变异进行相关研究。建立了快速、特异、灵敏和可甫0的ir2基因PCR检测方法，对265份临床肉源致病性大肠杆菌进行irp2进行检测，阳性率30.6%(81/265),这与Schubert"(27%)结果一致，高于张冬梅(14%)和陈伟13(21.6%),低于许丽*的(44%)和王蕤成的(4

22、7.8%)。这诃能与临床样品选取及流行潭株区域差异性有定相关性。获得了9株禽致病性大肠杆菌HP!irp2基因序列，与GenBank中参考廊株基因同源性高达96.2%以上，显示irP2基因在不同潭株间具有很高的保守性，这与玳炳敏(97%)和程伯爆(95.5%)等报道的同源性结果一致Jrp2等花力岛基因A度保守性可能与其在不同宿主菌株间的水平转移仃关，具体原因有待进一步研究。参考文献：1 忧籀.FK506萌株堆因组尺度代谢通ht分析指导下HJ级和次级途径改造：0.天津：天津大学化工学院.2013.2 邵独，涂健.汪雪雁.APEC强)力岛核心基因"fyuA敲除对JI致病性影响的研究J.中国

23、兽,学报.2014.34(4)：564-570.3DeAlmeidaAM,GuiyouleA,GuilvoulI.elal.Chronni-somulirp2grnrinYentitiia:distributionexpressiondeletionandini|Hielonvirukncr(J).MicmliialPathofrneNs.1993.14(1)：9-21.4CamirlE,Guiyoule*A,Meiferrau-Puijalon0,efal.Chromo-somalmarkerforlhe"high|Nilh<»geni<*il>'

24、;*pheno-lypt*inYrrsin-iaJ.ContributionstoMi<-n>biol<>g)umlImmunology.1991,12：192-197.5,PR<l<>NaM'imrnto.Ass<x-iati<>iiofPro-InflainnuiloryCylokiiifsandImuRegulatory-2(IRI2)with【"KhtnaniaBinxlfiiinCanineVisceralb-ishmaniusisJ'.PiosOne.2013.8(10)：6565.6WangWr

25、i.Ih-ngZhiyong,HalclwrHratlirr.ctal.IRI,2n-gu-latcslin'asitumorgrowthJ.CuncrrRm,2013Jan15；74(2)：497-507.7Ma(r<*llon<*(uinnen.(lhen(aiolnia,l)n»z<l<tvIgnal,clal.Tiiniori-grni«,pn>|MTticsofin»in*gulalonpnilein2(IIU,2)iiM,<liat<,<lbyitsspreim73-aminoa<i<Uii)M>rtJ.PLoSONE.2010.5(4)：l-ll.8程伯短，叶R罢.伍建宏.等.肠产志祝祥尚素的大肠肝俏帽株中小肠结肠炎耶尔女IW力岛基因切2的检测J.中华微生物学与免佼学杂志.2000.20(6)：489-492.9拥山,E意银.朱琼帔.等.阴沟肠HlWlW株中携带小肠结肠炎耶尔探倘推力岛irp-2基因的检测J.中国卫生检於杂志.2011.21(6):1317-1321.10Schu