基因枪法介导的魔芋遗传转化研究

1、收稿日期:2004-03-19*国家自然科学基金项目(39870541资助李贞霞,女,1973年生,硕士,讲师.工作单位:河南职业技术师范学院园艺系,新乡453003基因枪法介导的魔芋遗传转化研究*李贞霞1,2张兴国2(1河南职业技术师范学院园艺系,新乡453003;2西南农业大学园艺园林学院,重庆400716摘要 利用基因枪轰击法建立了魔芋的遗传转化体系。试验结果表明,氦气压力/轰击距离以7.58GPa/9cm 最适。在轰击前4h 和轰击后16h 用附加有0.4mol/L 甘露醇的M S 培养基进行高渗处理、轰击后恢复培养67d,有利于减少逆境伤害,增加转化成功的几率。早期选用1mg/L B

2、asta 作为选择压,而后期的筛选使用2mg /L 较高浓度的Basta 可以获得真正的转化子。对获得的91株抗性植株进行了P CR 检测,结果显示21株呈阳性,表明PA T 基因和A GPS 1反义基因均已整合进魔芋基因组。关键词 魔芋;基因枪;遗传转化中图法分类号 S 623.3 Q 785魔芋是由天南星科(Araceae魔芋属(A mor p hop hallus Blume的多年生草本植物1,其品种退化和更新缓慢是生产上的难题。因此对魔芋现有品种的品质进行改良,选育更优质的新品种是一个亟待解决的课题。品质改良的主要目标在于增加魔芋的葡甘露聚糖含量和减少淀粉的积累。葡甘露聚糖含量越高和淀

3、粉含量越低的品种,品位越高,加工出来的魔芋精粉产量越高,质量越好。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGP是植物淀粉生物合成的关键酶。它催化1 P G 和ATP 生成ADP 葡萄糖(ADPG。后者将作为淀粉合成酶的底物直接参与直链淀粉和支链淀粉的合成。在植物中,该酶是由2个大亚基(AGPL和2个小亚基(AGPS组成的异源四聚体。目前,该酶及其基因已经从玉米、小麦、菠菜等多种植物中得到分离纯化和研究。在不同物种间,小亚基高度保守,而大亚基相对变幅较大;小亚基是酶的活性中心,而大亚基则主要起调节作用。1993年美国M osounto 公司将来自大肠杆菌的A GP 基因导入马铃薯,其块茎的淀粉和干物质含量

4、平均提高24%;相反,若导入该酶的反义基因,则淀粉含量下降到只有对照的2%。因此通过对该酶的遗传操作,可以达到显著增加或减少植物体内淀粉含量的目的。本研究探讨了魔芋基因枪转化A GPS 1基因的条件,并对获得的转基因植株进行PCR 验证、为今后利用基因工程技术进行魔芋育种和品质改良打下基础。1 材料与方法1.1 材 料受体材料为白魔芋愈伤组织。质粒为pPAT AGPS1,上含有p at 基因(除草剂抗性基因和A G PS 1反义基因。愈伤培养基为M S +1mg/L 6 BA +1mg/L NAA +6g/L 琼脂+30g/L 蔗糖。分化培养基为M S +1mg /L 6 BA +0.05mg

5、/L NAA +6g/L 琼脂+30g/L 蔗糖。1.2 微弹的制备称取7.5mg 直径为1mm 的金粉放入灭菌的离心管中。加入1mL 70%的乙醇振荡悬浮,放置过夜。5000r/min 离心3min,弃上清,收集金粉。重复以下步骤3次:加1m L 的无菌水,涡旋1min,放置1min,离心沉淀金粉,去上清。加入无菌双蒸水120 L 重悬,于4 保存备用。每次使用前吸取上述金粉悬浮液40 L 至离心管中。加入5 L 质粒DNA(1 g/ L,充分振荡。加入50 L 2.5mol/L 的CaCl 2和0.1mol 亚精安,并充分混匀。静置2min 后分别用70%和100%的乙醇洗2遍。最后加入5

6、0 L 的100%乙醇,4 保存,每枪上样10 L,可轰击5枪。1.3 轰击前后材料的处理轰击前将3040块0.5cm 2见方大小的受体材料置于培养皿(直径9cm中心直径不大于3cm的范围内。分别于轰击前4h和轰击后16h内进行渗透处理,渗透培养基为愈伤组织培养基附加0.4 mol/L的甘露醇。1.4 轰击后转化子的筛选轰击后的材料经渗透处理后转入愈伤组织培养基附加100mg/L的Carb中恢复培养67d。再转入含有除草剂Basta的分化培养基中继代培养筛选。1.5 受体材料对除草剂Basta的敏感性试验将愈伤组织置于含有Basta0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50

7、、1.75、2.00mg/L的分化培养基上,每隔2周换1次培养基,45d后观察并记录存活外植体数,芽分化外植体数。1.6 最适的氦气压力及轰击距离不同的氦气压力及轰击距离对受体材料造成的创伤不同。受体材料轰击后培养3个月,观察统计愈伤组织存活数及抗性芽数,确定最适于魔芋愈伤组织的最佳轰击距离及压力。1.7 抗性芽的PCR检测对获得的抗性芽先进行A GPS1反义基因的PCR检测,对呈阳性的植株再进行PAT基因的检测。反应体系及反应程序如下:200 L薄壁管中含有无菌水17.378 L,10!PCR buffer2.5 L,25 mmol/L MgCL21.5 L,10mmol/L dNPTs0.

8、5 L, 5引物1 L,3引物1 L,TaqDNA酶0.125 L,模板DNA1 L,共25 L。PCR反应程序:943min,1个循环;941 min,551min30s,722m in30s,共35个循环;7210min,1个循环。以质粒pBIN AGPS1的DNA为阳性对照(+ CK,非转化植株基因组DNA为阴性对照(-CK。10 L PCR产物在含EB的1%琼脂糖凝胶中电泳,紫外灯下观察照相。2 结果与分析2.1 除草剂Basta对魔芋愈伤组织分化的影响在试验中发现不同浓度的Basta均会在一定程度上抑制愈伤组织的生长。2mg/L的Basta使愈伤组织致死。在愈伤组织的分化过程中,1m

9、g/L Basta就足以抑制正常的芽的再生,即使分化的芽也很难生长(见表1。表1 Basta对魔芋愈伤组织分化的影响Table1 Effects of Basta on the differention of calliof Am orphophallus albusB asta浓度/mg#L-1接种愈伤组织数1存活外植体数2分化芽外植体数3芽分化率/%41.50800001.75800002.00800001I n oculated callus numbers;2Survived explant numbers;3Explant nu mbers with bud differentiat

10、ion;4Differentiation rate of buds 在实际的筛选过程中为了得到真正的转化子,我们初期采用1mg/L的Basta为筛选压,筛选培养68周后降为Basta 0.75mg/L,以利于转化细胞的再生,得到抗性芽后再逐步提高筛选压的浓度。后期筛选验表明,真正的转化子即使在2mg/L Basta的高浓度筛选压下也能继续生长。2.2 轰击的氦气压力及轰击距离对转化的影响基因枪的轰击参数中,氦气压力对转化效率有一定的影响。气压大小决定子弹的速度和入射深度,能否有效地将子弹射入具有分化潜能的细胞层是转化能否成功的关键之一5。本研究采用4种不同的氦气压力及轰击距离,比较结果发现较低

11、的氦气压力和适当的轰击距离有利于愈伤组织的转表2 氦气压力/轰击距离对转化的影响T able2 Effects of H e press ure and bombardmentdis tance on transformation氦气压力/轰击距离1Gpa/cm受体愈伤组织数2存活愈伤组织数3抗性芽数410.7/121751129.31/121852167.58/1220027137.58/919042231He pres sure/bombardment distance;2Callu s numbers of acceptors;3Survival callu s numbers;4Num

12、bers of buds with resis tance660 华中农业大学学报第23卷化(见表2。魔芋具有分化潜能的细胞位于愈伤组织的表层,较低的氦气压力和适当的轰击距离将有助于子弹击中这些细胞层,提高转化的发生频率。2.3 转化体的筛选和抗性植株的获得基因枪轰击后的愈伤组织在愈伤组织培养基附加100mg/L Carb 的培养基中过渡培养67d 后,转接于分化培养基附加有100mg/L Carb 和Basta 1mg/L 的培养基中筛选培养,每隔2周换1次培养基。经过34次转接后,大部分愈伤组织褐化或白化,死亡,少部分愈伤组织色泽正常,并有所增大,继续培养后发出绿芽(见图1。2.4 抗性芽

13、的PC R 检测1抗性芽的AG PS 1反义基因的PC R 检测。在基因枪转化试验中,共轰击5次,每次5枪,轰击魔芋愈伤组织近1000块,经69个月的培养,共得抗性植株91株,PC R 检测结果显示21株呈阳性。扩增仍以未转化植株D NA 为阴性对照(-C K,质粒pPA T AG PS 1为阳性对照(+C K。(见图2。2抗性芽的Pat 基因检测。对AGPS 1反义基因PCR 检测呈阳性的抗性植株,进行Pat 基因检测,以质粒pPAT AGPS 为阳性对照, 以未转化植图1 抗Basta 魔芋愈伤组织的筛选Fig.1 Selection of Basta resistant calli of

14、 Konj ak onmedium containing 1mg/L of Basta左:对照Left CK;右:转化体Right T ransformant图2 A GPS 1反义基因转化植株的PC R 检测Fig.2 PCR detection of transgenic plants of AGPS 1antonymy gene (primersA/DM:1kb Marker ;16:转化植株Transgenic plants ;7:未转化植株No transgenic plants;8:pPAT AGPS 1图3 转化植株Pat 基因PCR 检测Fig.3 Pat gene of tr

15、ansgenic plants by PCR amplif icationM:Marker 16:转化植株Transgenic plants;7:阴性对照Negative control;8:阳性对照Positive control株的基因组DNA 为阴性对照(见图3。结果发现,AGPS 1反义基因PC R 检测呈阳性的,Pat 基因检测有的并未呈阳性,这可能与基因整合的过程有关。3 讨 论基因枪法是继原生质体介导法之后广泛使用的单子叶植物遗传转化手段。该方法具有多种优点如:(1能转化任何植物,特别是那些由原生质体再生较为困难和农杆菌感染不敏感的单子叶植物。(2能转化植物的任何细胞和组织。目前

16、,为了提高基因枪的转化效率,多以优化操作参数,包括轰击距离、轰击速度、金粉及DNA 的用量等和转化前后用高渗处理来提高瞬时表达。其中研究较多的就是金粉和DNA 的用量问题。金粉颗粒(吸附有一定量的DNA的数量越多,轰击时对细胞造成的损伤程度越大,如果细胞受伤过大,以至于不能恢复或恢复得很慢,则外源基因的整合及表达就会受阻,从而降低转化频率。米庆莉等2在研究水稻时发现:粳稻细胞对金粉颗粒造成的损伤程度不敏感,较高用量的金粉(1 g DNA 用500 g 金粉转化时,可得到较高的瞬时表达。籼稻细胞对金粉颗粒造成的损伤却不敏感,只有当金粉颗粒用量减少到一定程度(0.25 g DNA 用125 g 金

17、粉,才能得到较高的瞬时表达。梁辉等3轰击培养14d 左右的小麦幼胚愈伤组织,每枪0.5 g DNA 用250 g 金粉较好。可见,材料不同所选用的金粉和DNA 用量也是不同的。基因枪轰击前后的高渗处理也是提高转化效率的重要因素。Vain 等最先将渗透压处理方法用于玉米的基因枪转化,结果表明,用0.4Mpa 的渗透压在轰击前4h 和轰击后16h 处理,可将G U S 瞬时表达提高2.7倍,稳定表达增加6.8倍4。高渗处理影响转化的原因在有关文献中已有提及,但还不是很清楚。可能是因细胞在高渗条件下发生了质壁分离,从而减少了在微弹穿孔时细胞质泄漏,而提661 第6期李贞霞等:基因枪法介导的魔芋遗传转

18、化研究高了细胞的生存力。在我们的试验中,高渗透压处理也显示出较好的效果,但最适选择压浓度和处理时间各有不同,还需要进一步探索和研究。基因枪转化技术从诞生至今十几年时间里,已取得了可喜的进展,但还有不少问题值得进一步研究,例如:转化效率低,稳定遗传的比例较差,外源DNA的整合机理不清楚等。相信随着科技的发展,基因枪转化技术的理论研究和应用研究都将得到更好的发展。参 考 文 献究中心选编.中国魔芋论文选集(第一分册.重庆:西南农业大学出版社,1995.29332 米庆莉,何锶浩,曹守云.籼稻及粳稻对基因枪转化反应的差异及提高转化率的研究.农业生物技术学报,1998,6(3:2632683 梁 辉,

19、赵铁汉,李良材.影响基因枪法转化小麦幼胚的几个因素的研究.遗传学报,1998,25(5:4434484 Vain P,McMuiien M D,Finer J J.Os motic treatment enhances particle bombardment mediated transient and stabletrans formation of maize.Plant Cell Reports,1993,12(2:84885 赵 虹,李名扬,裴 炎.基因枪转化小麦几个影响因素的研究.四川大学学报,2001,38(4:570574Genetic Transformation of Am

20、orpho phallus Mediated by Gene GunLi Zhenx ia1,2 Zhang Xingguo2(1Dep ar tment of Horticulture,Henan Vocation T echnical Teachers College,X inx iang453003,China;2College o f H or ticulture and L andscap e,Southw est Agr icultur al Univer sity,Chongqing400716,ChinaAbstract Genetic transformation system of A morp hop hallus w as established via gene g un.Results showed t