器官移植术后的嵌合现象

1、    器官移植术后的嵌合现象        摘要为研究器官移植术后的嵌合现象，术后利用聚合酶链反应(PCR)技术检测3例接受男性供体器官的女性受者外周血及皮肤组织中的Y染色体特异性DNA片段。结果在1例小肠移植受者的外周血及皮肤组织中出现Y染色体特异性DNA片段；2例肾移植受者的外周血中也出现Y染色体特异性DNA片段。表明在器官移植术后存在着供体细胞向受体组织的移行嵌合。认为促进嵌合的出现及保持嵌合的平衡，将有利于防治排斥反应和移植物抗宿主病。关键词移植移植物生存Y染色体聚

2、合酶链反应 Study on organ transplantation chimerism by polymerase chain reaction techniqueJiang Zhiwei, Li Jieshou, Li Nin, et al. Nanjing General Hospital of Nanjing Command of PLA, Nanjing, 210002AbstractIn order to investigate the organ transplantation chimerism, 3 female patients receiving male donor

3、 grafts were selected to detect a Y chromosome specific DNA fragment to further identify the presence of donor cells based on sex difference between donor and recipient by using polymerase chain reaction (PCR). Y chromosome specific DNA fragment are found in peripheral blood and skin of one recipien

4、t undergoing small bowel transplantation, and in peripheral blood of 2 recipients undergoing renal transplantation. The results indicated that the donor cells migrated to the recipients tissue. It was suggested that chimerism and the maintainance of chimerism balance would be of benefit to the preve

5、ntion and treatment of rejection and graft versus host disease.Key wordsTransplantation Graft survival Y chromosome Polymerase chain reactionStarzl等1，2提出免疫耐受的嵌合(chimerism)理论，认为器官移植术后供受体间存在着广泛的细胞移行和嵌合，它是移植物长期存活及产生免疫耐受的基础。我们选择了3例女性移植患者，她们均接受了男性供体器官，利用聚合酶链反应(PCR)技术扩增Y染色体特异性DNA片段，发现女性受者术后的外周血及皮肤组织中存在着含Y

6、染色体的供体细胞，表明在移植术后供体细胞向受体组织移行嵌合。现将我们在小肠移植及肾移植患者术后观察到的嵌合现象报告如下。资料与方法一、 病例选择：选择接受男性移植物的女性移植受者3例，其中小肠移植1例3，31岁；肾移植2例，分别为28岁和32岁。二、 标本留取：小肠移植患者分别于术后192天、200天、210天取外周血标本1份，术后192天取皮肤活检标本1份。肾移植患者分别于术后9天、92天取外周血标本1份。三、 PCR扩增Y染色体特异性DNA序列： 1. 基因组DNA提取：取1.5ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，加入2×蔗糖-Triton-100溶液， 混匀至红细胞溶血，1

7、500g离心15分钟，在细胞沉淀中加入1.5ml EDTA-Na，匀浆液匀浆后，加入1/10体积10% SDS和蛋白酶K(终浓度100mg/L)，37水浴34小时，用等体积饱和酚、11酚-氯仿及氯仿分别抽提1次，加入1/10体积3mol/L NaCl及2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，75%(V/V)乙醇洗沉淀1次，适量三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸二钠缓冲液(TE缓冲液)溶解DNA，4贮存备用。2. 目的DNA序列扩增：使用复旦大学产人性别PCR鉴定试剂盒，以Alu特异性DNA序列引物作对照，首先进行试剂盒特异性及敏感性试验。随机扩增5男5女基因组DNA行特异性试验； 敏感性试验将男女总DN

8、A含量按11、12、14、18、116、132、164的比例稀释后再扩增。目的DNA扩增总反应体积为20l，内含高纯水、5×buffer、引物、dNTP、样本DNA，92.5水浴7分钟后加入1U Taq酶，92.5 30秒(变性)，55 30秒(退火)，70 90秒(延伸)，30个循环。3. 检测：取10l扩增产物，用1%琼脂糖凝胶(含EB)电泳，紫外灯下观察结果及拍照。男性Y染色体特异DNA片段为446bp，女性总DNA不出现扩增片段。Alu序列扩增片段大小为130bp，无论是男性还是女性扩增后都会出现。结果一、移植术后临床及组织病理学观察：3例患者在观察期间均无排斥及移植物抗宿主

9、病(GVHD)发生。小肠移植患者术后4个月即停止了全胃肠外营养， 恢复口服饮食， 营养良好。肾移植患者术后2周血尿素氮、肌酐恢复正常水平。二、PCR特异性试验结果：Alu序列为人体基因组中的中度重复序列，分布于所有人体细胞基因组中，作为对照以防假阴性。本研究中Alu序列无论是男性还是女性均为阳性，而Y染色体特异性DNA序列仅见于男性。三、PCR敏感性试验结果：男女总DNA量按164稀释时仍可见扩增出Y染色体特异性DNA。四、移植患者的外周血及皮肤PCR扩增结果：小肠移植术后192天、200天、210天外周血及192天的皮肤组织中均可检出Y染色体特异性DNA片段；肾移植患者术后9天、92天时外周

10、血中检出Y染色体特异性DNA片段，而术前各患者外周血PCR扩增Y染色体均为阴性。讨论Starzl等于1991年在小肠移植研究中发现，术后供肠与受体之间存在着互相的细胞移居及共存的嵌合现象，临床无排斥和GVHD的发生，于是他们首次提出了嵌合现象可能存在于所有成功的器官移植术后4。嵌合理论的核心是细胞移行嵌合是移植物存活及产生免疫耐受的基础，其中参与嵌合的主要细胞是树突状细胞，移行主要通过血管途径，嵌合发生的部位广泛，在外周血、淋巴结、骨髓、皮肤、肝脏等处都可发生。我们在小肠移植术后200天左右于受者的外周血及皮肤组织中都发现了供体的嵌合细胞。GVHD的发生与嵌合的失平衡有关。虽然在小肠等器官移植

11、术后存在着广泛的供体细胞向受体的移行嵌合，但在有效免疫抑制下，并不发生GVHD，少数受体发生GVHD，主要是因为供体细胞大量侵犯破坏受体组织，嵌合状态失平衡所致，纠正了失衡状态可逆转GVHD。所以在小肠移植术后需警惕GVHD的发生，但没有必要在术前对供体或供肠进行放射线照射或去除肠系膜淋巴结等免疫预处理，预处理可能反而有害。本课题为国家自然科学基金资助项目作者单位：210002南京军区南京总医院全军普通外科研究所参考文献1Starzl T, Demetris A, Truccco M, et al. Cell migration and chimerism after whole-organ transplantation: the basis of graft acceptance. Hepatology, 1993, 17:1127.2Starzl T, Demetris A, Murase N, et al. Donor cell chimerism permitted by immunosuppressive drugs: a new view of organ transplantation. Immuno Today, 1993, 14:326. 3李宁，黎介寿，李幼生，等. 首例临