反相高效液相色谱法测定重组大肠杆菌发酵液中降血压肽的含量

1、反相高效液相色谱法测定重组大肠杆菌发酵液中降血压肽的含量                作者：廖晓慧 孙海燕 刘冬 彭光华 张声华【摘要】  目的建立反相高效液相色谱（RPHPLC）测定重组大肠杆菌发酵液中降血压肽的方法，为其深入研究提供方法学基础。方法采用Aydac C18反相柱（4.6 mm×250 mm,5 m），Aydac保护柱，柱温30 ，以乙腈水(2278) ，0.05%TFA为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长21

2、5 nm，参考波长350 nm，进样量20 l。结果该方法使降血压肽与其它相似产物得到较好分离，在5250 g/ml内线性关系良好，r=0.999 8，最低检测限达8 ng，低、中、高浓度下的加样回收率、日内、日间精密度均符合方法学要求。结论 该方法稳定、灵敏度高、操作简便、适用于重组降血压肽的含量测定。 【关键词】  重组大肠杆菌； 降血压肽； 反相高效液相色谱Abstract：ObjectiveA simple and rapid reversed-phase high performance liquid chromatographic method was developed

3、 for the AHP in Recombinant E.coli fermentation broth.MethodsThe separation conditions were: Aydac C18 reversed phase column, Aydac guard column. Mobile phase was acetonitrilewater(2278),0.05%TFA,flow rate 1ml/min.The detection wavelength was 215nm,reference wavelength was 350 nm.Column temperature

4、was 30.Injection volume：20 l. ResultsAHP has good separation from other components in fermentation broth. And there was perfect linear correlation between 5250 g/ml, r=0.999 8. The limit of detection was 8ng. The intra-and inter-assay precisions, recovery met the methodology requirements.ConclusionT

5、his method had high precision,high accuracy and was easy-manipulated. This method proved to be suitable for AHP.Key words：Recombinant E.coli;   Antihypertensive peptide;   RP-HPLC   降血压肽（antihypertensive peptide，AHP）是一类能够降低人体血压的小分子多肽。它通过抑制RAS系统的ACE活性而降低血压。降血压肽来源于天然动、植物及

6、微生物，具有降血压效果明显、无毒副作用等优点。因此，已成为目前抗高血压药物研究的热点之一13。   利用基因工程生产降血压肽，克服了直接从动植物、微生物原料中分离提取降血压肽筛选水解酶类的盲目性（特异性蛋白水解酶事先选定），以及纯化工艺的复杂繁琐性，而且不受原料来源的限制，生产周期短，下游分离纯化工艺简单，除具有高效表达外源蛋白的能力、完善的翻译后加工机制外,还能在常规条件下进行高密度培养,有利于工业化生产。   RPHPLC的一个主要应用领域就是多肽和蛋白质的制备和分析。对于分子结构比较简单的多肽和某些蛋白质,在不影响产物的活性或产物在RPHPLC后很

7、容易重新折叠复性的前提下,用RPHPLC进行纯化制备是一项高效的手段。同时,RPHPLC分辨率高和重复性好的特点,使它在蛋白质及多肽分析领域占据核心地位。1  器材1.1  仪器高效液相色谱仪Agilent 1100，自动进样器Agilent 1100，二极管阵列式检测器Agilent 1100，系统控制器Agilent 1100，色谱工作站Agilent1100，均为美国Agilent公司出品；分析柱Aydac C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 m），美国Aydac公司；保护柱（guard column），美国Aydac公司；高速离心机Centrif

8、uge 5810R，德国eppendorf公司；一次性针头式过滤器0.45 m，美国millipore公司。1.2   试剂降血压肽标准品由上海华大天源生物科技有限公司按LysValLeuProValPro氨基酸序列合成，纯度95%；发酵样品由深圳市发酵精制重点实验室制备；乙腈HPLC级，天津协和昊鹏色谱科技有限公司；三氟乙酸（TFA）HPLC级，美国sigma公司。实验用水均为18.2超纯水。2  方法2.1  标准储备液的配制精密称取0.020 0 g标准品，溶于超纯水中，定容至10 ml容量瓶中，即得2 mg/ml标准储备液。2.2  发

9、酵样品的处理发酵液经离心，收集菌体细胞，破碎，亲和层析，酶切等分离、纯化过程而得，经0.45 m滤膜过滤，HPLC进样。2.3  色谱条件色谱柱：Aydac C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 m），Aydac保护柱；流动相：乙腈水(2278)，0.05%TFA；流速：1.0 ml/min；检测波长：215 nm，参考波长350 nm；柱温：30；进样量：20 l 。2.4  标准曲线的制定取2.1项下配制的标准储备液分别稀释成250，100，50，20，10，5 g/ml标准溶液，0.45 m滤膜过滤，20 l进样，以峰面积对质量浓度进行线性回归。2.

10、5  精密度实验2.6   回收率实验采用标样添加法，取100，50，20 g/ml 3个浓度的发酵液分别添加浓度为50 g/ml的标准液至理论值分别为150，100，70 g/ml进样测定，测定峰面积，计算回收率。3  结果3.1  色谱行为考察本实验选择水加乙腈作流动相，TFA作阴离子对试剂，针对不同的乙腈和TFA浓度及洗脱速度对降血压肽的洗脱峰形、分离效果进行研究。研究表明，影响分离度的因素主次依次为乙腈浓度TFA浓度洗脱速度。从相邻峰的分离度和缩短分析时间综合考虑，最终优化条件为乙腈浓度22%，TFA0.05%，洗脱速度1 ml/min

11、。AHP的保留时间为4.154.20 min之间。标准品与样品的色谱图如图12。图1  降血压肽标准品色谱图（略）图2  发酵样品中的降血压肽色谱图（略）3.2   线性考察及最低检测限以250，100，50，20，10，5 g/ml为标准系列溶液，0.45 m滤膜过滤，20 l进样，以峰面积对质量浓度进行线性回归，得标准曲线如图3。实验表明， 5250 g/ml范围内呈现良好的线性关系。r=0.999 8。         图3  降血压肽标准曲线（略） 

12、0;  当进样浓度为0.4 g/ml，S/N =3即最低检测限为8 ng。3.3  精密度日内、日间精密度结果如表1所示。RSD在0.0071%0.0812%之间。3.4  加样回收率取100，50，20 g/ml 3个浓度的发酵液分别添加浓度为50 g/ml的标准液至理论值分别为150，100，70 g/ml进样测定。结果见表2。3.5  样品测定分别取3个批次的发酵液，经样品处理，按上述方法测定其中的降血压肽含量，结果如表3所示。4  讨论   迄今为止，日本是研究AHP最多的国家，早在20世纪80年代就对降血压肽进行了

13、广泛的研究，采用各种廉价的原料蛋白开发了多种ACE抑制肽功能因子添加到食品中，取得了很好的经济社会效益。我国在AHP方面的研究，前景非常喜人。建立一套适宜的分离分析技术，是将降血压肽推向商业化生产的关键，分离提取的效率也会直接影响到它的应用前景。降血压肽的分离分析甚至结构鉴定是一项最复杂，也是最有意义的工作。表1  降血压肽的精密度（略）表2  降血压肽的回收率（略）表3  发酵样品中AHP含量的测定（略）基因工程技术的发展及蛋白质研究的不断深入，必然需要灵敏、快速、准确的分析方法的支持。肽和蛋白质在溶液中的扩散系数比较小，黏度大，外界温度、介质的pH值、有机溶剂

14、性质等会导致其结构改变，产生变性。而RP-HPLC的溶解能力较大且RP-HPLC柱效高、分离能力强、保留机理清楚，与其它色谱方法相比，具有分辨率和回收率高、重复性好、操作简便等优势，对于肽和蛋白质的分离分析，RP-HPLC正受到越来越多的关注46，非常适合于发酵液这种复杂体系中降血压肽的定量分析，也为其他小分子肽类物质的定量分析提供了有效的科学依据。并且对推动我国多肽类保健食品、药品的产业化具有重要意义。   由于RP-HPLC较高的分辨率及独特的选择性，作为一种蛋白质及多肽的分离分析手段已越来越得到人们的认可，并用于许多新兴领域如蛋白质组的分析。多种联用技术如RP-HPL

15、C质谱、RP-HPLC毛细管电脉及RP-HPLC生物传感器的出现也使得更加快速的在线分析成为可能，实现了对样品各成分分子量、纯度及活性等的实时分析。相信随着对RP-HPLC分离机理研究的逐步深入、分离体系的不断完善及各种检测手段如质谱技术的快速发展，反相液相色谱法必将在蛋白质及多肽研究领域得到更加广泛的应用。【参考文献】  1 Yamamoto N.Antihypertensive peptide derived from food proteins.J BiopolymersJ.1997,47:119.2 Yamamoto N,Ejiri M,Mizuno S.Biogenic peptides and their potential useJ.Curr Pham Des,2003,9:1345.3 Yoshikawa M,Fujita H,Matoba N,et al.Bioactive peptid