化氢对血管性痴呆大鼠的海马CAl区细胞凋亡的作用

1、化氢对血管性痴呆大鼠的海马CAl区细胞凋亡的作用【关键词】 硫化氢 痴呆 大鼠1996年Abe等1首次证实人体内源性硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）可能是一种神经活性物质，内源性H2S可增强脑N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体调节的反应，诱导海马长时程增强（1ong term potentiate，LTP），对学习和记忆有重要的调节功能2。因此H2S被认为是继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第3种内源性气体信号分子3。本实验旨在了解H2S对血管性痴呆大鼠的海马CAl区细胞凋亡的作用。 1 材料与方法 11 动物模型制作 参照 Pulsinelli 四血管阻断法（4

2、-VO法）建立痴呆（VD）大鼠模型4。10%水合氯醛（3mikg体重）腹腔麻醉大鼠后，经颈背部正中切口，暴露第一颈椎两侧翼孔，电凝走行其下方的椎动脉，使其永久性闭塞。48h后，将大鼠用乙醚麻醉后，仰卧固定在手术台上，常规消毒，颈正中切口，分离双侧颈总动脉（CCA），待动物清醒后用无创伤动脉夹夹闭双侧颈总动脉5min，共夹闭3次，每次间隔1h，造成全脑缺血，再通后缝合伤口，放回笼中保温饲养，以再通时间作为再灌起始点。术后按再灌注的不同时间分别将大鼠处死。 12 实验分组 56只纯系健康雄性Wistar大鼠，将动物随机分为7组，正常组（Normal group），即假手术组（Sham-operat

3、ed group）和VD模型组（VD group），VD模型组又分为大脑缺血再灌注2小时（IR 2h）组，大脑IR 8h组，大脑IR 24h组，大脑IR 72h组和大脑IR 168h组，每组8只动物，假手术组麻醉及手术过程与VD模型组相同，但不电凝双侧椎动脉，不阻断双侧颈总动脉。 13 脑组织病理学指标 脑组织切片，HE染色，光镜下观察脑组织病理变化情况；免疫组化染色观察脑组织内Bcl-2和Bax凋亡蛋白的分布情况。 14 海马神经细胞凋亡率检测 将大鼠海马组织制成单细胞悬液，EB染色后应用美国Beckman Coulter公司生产的Epics-XL 型流式细胞仪进行检测。 15 血清中H2S

4、含量的检测 应用亚甲蓝分光光度法检测血清中H2S含量。 16 外源性H2S对VD大鼠海马神经细胞凋亡的影响 大鼠再造模的同时，腹腔注射硫氢化钠（NaHS）（14molkg体重），7天后处死动物，经主动脉依次灌注生理盐水100ml和4%多聚甲醛500ml，取出脑组织，石蜡包埋切片，免疫组化方法检测Bcl-2、Bax，HE染色法观察组织形态变化，亚甲蓝分光光度法检测血清中H2S含量。 17 统计方法 所有实验参数以均数标准差表示，P005为显著性差异。 2 结果 21 VD大鼠病理形态学结果 HE染色后，神经细胞胞浆呈淡红色，核呈蓝黑色。假手术组大鼠海马CA1区神经元排列整齐、密集，细胞完整，结构

5、正常，胞浆丰富，胶质细胞无增生：细胞核呈圆形、椭圆形，无变性，无固缩或溶解现象（图1 A）。VD模型组海马CAl区神经元排列紊乱，神经元变性，体积变小，胞核与胞浆界限不清，核固缩成三角形或不规则形，而且随缺血再灌注时间的延长，变性神经元数目越多（图1 BF）。 22 凋亡蛋白表达结果 221 VD大鼠海马CAl区Bcl-2的表达 VD模型组IR 2小时，Bcl-2蛋白平均光密度值开始明显上调，IR 8h达到高峰，之后随缺血再灌注时间的延长开始下降，但IR 24h组仍高于假手术组（P005）。各组两两比较可见假手术组，缺血再灌注不同时间组间，海马CA1区Bcl-2的表达情况均有显著性差异（见表1

6、）。 222 VD大鼠海马CAl区Bax的表达 缺血再灌注早期Bax在海马CA1区的表达明显增强，随着再灌注时间的延长，其表达量不断增加，IR（72168）h达高峰。各组两两比较可见假手术组，缺血再灌注不同时间组间，海马CA1区Bax的表达情况均有显著性差异（P005，见表2）。 223 VD大鼠海马CAl区Bax的表达 缺血再灌注早期Bax在海马CAI区的表达明显增强，随着再灌注时间的延长，其表达量不断增加，IR72-168h达高峰。各组两两比较可见假手术组，缺血再灌注不同时间组间，海马CAl区Bax的表达情况均有显著性差异（P005，见表2）。 224 Bel-2Bax比率变化 缺血再灌注

7、2小时，Bcl-2Bax比率最高（IR 2h10631），随后开始下降，呈现随缺血再灌注时间的延长而逐渐降低的趋势。 225 流式细胞术检测海马神经细胞凋亡率结果 随着缺血再灌注时间的延长，大鼠海马神经细胞凋亡率逐渐增高，海马神经细胞凋亡率呈现对数曲线上升趋势（图2），其中IR 168h组海马神经细胞凋亡率最高（1205%056%）。VD模型各组与假手术组比较，海马神经细胞凋亡率明显增加（P00）；缺血再灌注不同时间组间两两比较发现：各组间海马神经细胞凋亡率均有显著性差异（P001，见表3）。 226 血清H2S含量检测结果 随着缺血再灌注时间的延长，大鼠血清H2S含量逐渐降低，血清H2S含量

8、呈现直线降低趋势（见图2），其中IR 168h组血清H2S含量最低（1351045）。VD模型各组与正常组和假手术组比较，血清H2S含量明显减少（P001）；缺血再灌注不同时间组间两两比较发现，各组间血清H2S含量均有显著性差异（P001）；正常组和假手术组血清H2S含量无统计学差异（P005，见表4）。 237 血清H2S含量与海马神经细胞凋亡率相关分析 随着血清H2S含量的降低，海马神经细胞凋亡率逐渐升高，两者呈现负相关，回归方程为：y-0135x+12068，相关系数r=-0.861（P001，见图3）。 23.8 外源性H2S对VD大鼠海马区神经细胞病变和凋亡的影响 HE染色后发现，外

9、源性H2S应用后，神经元排列紊乱和变性程度明显减轻（见图4）。 3 讨论 众所周知，参与H2S合成的主要酶是胱硫醚-合酶（cystathionine-beta-synthase，CBS）和胱硫醚-裂解酶（cystathionine-gamma-lyase），而CBS主要分布于中枢系统的海马、小脑、皮层和脑干，是中枢神经系统合成H2S的主要酶，因此CBS的活性直接关系到脑内H2S的水平，CBS其C末端含有一个19个氨基酸残基组成的调钙蛋白区，在基础状态下CBS的C端弯向并覆盖催化区域，此时该酶无活性，当Ca2+/调钙蛋白或S-腺苷甲硫氨酸结合到该区后，CBS的立体构像发生变化即可激活CBS5,6

10、。 实验发现，在缺血再灌注的早期（8小时）海马CAl区的Bcl-2的密度明显增加（表1），这可能与早期CBS酶活性增加有关，因为在急性缺血缺氧时神经细胞反馈性的增加了内源性H2S的生成，究其原因可能与Ca2+内流增加、代偿性的谷氨酸释放增加有关，但随着缺血再灌注的时间延长，这种代偿机制不能克服细胞凋亡数的增加而逐渐消失。 而当加入硫氢化钠（NaHS）后，由于NaHS可解离成钠离子（Na+）和硫氢根（HS-），硫氢根可与体内氢离子（H+）结合生成H2S，从而使神经细胞在形态和排列上的紊乱得以减轻 （图4）7。 本实验可以明显看到神经细胞的凋亡与H2S之间呈负相关性，H2S的含量越低，细胞凋亡的现

11、象越严重，因此为我们探究减少神经细胞的凋亡、防止或减少血管性痴呆的途径，引发了新的思考。【参考文献】 1 Abe K， Kimura H The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous neuromodulatorJ Neurosci， 1996， 16：1066-10712 Em K， Ogasawara M， Umanura K， et al Hydrogen sulfide is produced in response to neuronal excitationJ J Neurosci，2002, 22（9）：3386-3

12、3913 Wang R Two?蒺s company, three?蒺s a crowd Can H2S be the third endogenous gaseous tranamitter？J.FASEB J，2002,16（13）：1792-17984 Pulsinelli WA， Brierley JB A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized ratJ SPoke，1979，10：267-2725 Kimura H.Hydrogen sulfide as a neuromodulatorJ Mol Neurobiol，2002，26（1）：13-196 Kimura Y， Kimura H Hydrogen sulfide protects neurons from oxidative stressJ FASEB J，2004，