器官保存液及其分子机制的研究进展

1、器官保存液及其分子机制的研究进展                        作者：白军强，张权宇，裴建明【摘要】  器官保存液应用于心脏移植，扩大了心脏移植术的适用范围，提高了心脏移植术的成功率。但有效保存时间较短（46h），限制了终末期心脏病人的手术治疗。本文介绍了：（1）已有的器官保存液；（2）一种新的心脏停搏剂-钾离子开放剂（PCOs），其不仅可以停搏心脏，而且对心肌

2、细胞、冠状动脉内皮细胞和平滑肌细胞也有较好的保护效果；（3）新型的能量物质添加剂ATP脂质体（ATP-Load liposomes, ATP-L）；（4）腺苷介导的心肌保护作用的具体机制；（5）心肌缺血再灌注的损伤机制及如何减轻缺血再灌注损伤方法及分子机制；（6）心脏受到损伤刺激时的内源性保护机制。 【关键词】  器官保存液；钾离子开放剂；ATP-L；缺血再灌注损伤；内源性保护机制    心脏移植术被确认为终末期心脏病的重要治疗方法，其中一个决定因素是供体心脏的保存。目前，心脏冷缺血有效保存时间被限制在46h ，严重影响了心脏移植术的应用。对器官保存液进

3、行改进，可延长供体心脏的保存时间和保存质量，扩大了心脏移植术的应用范围，提高了手术的成功率和病人远期的生存率。但延长供体心脏的停留时间，不可避免地加重了心肌损伤1。本文将介绍：首先在供体心脏采集后，用一种新型的停搏剂-钾离子开放剂PCOs）。继而加入一种新型的能量物质（ATP脂质体（ATP-Load liposomes,ATP-L），作为供体心脏离体保存的能量物质；也介绍了ATP分解产物腺苷和肌苷心肌保护作用的分子机制。接着系统地介绍了能减轻缺血再灌注的添加剂及其分子机制。最后介绍了缺血再灌注期一些内源性心肌保护作用及分子机制。    1  目前常用的心

4、脏保存液介绍    1.1  UW液（University of Wisconsin solution）  UW 液是美国威斯康星大学Belzer 及其小组人员研制的一种新型保存液： （1）渗透压由无代谢活性的惰性成分来维持，如乳糖酸和木棉糖；（2）加入了一种胶体成分，羟乙基淀粉(HES)；（3）加入氧自由基清除剂，如谷胱甘肽、别嘌呤醇等。UW 液被广泛应用于各种器官的保存，均有很好的保存效果。但是UW 液中高钾(125mmol/L)对心肌细胞及冠状血管内皮细胞能造成损害，同时UW 液的高黏滞性也减弱其保存效果。在UW液中加入caspases抑

5、制剂可以对抗高钾停搏液和复温后细肌丝收缩功能的异常，其可能机制为维持心肌细胞内肌丝的有序排列2。    1.2  ST液（St. Thomas' Hospital cardioplegia）      ST液是一种细胞外类晶体保存液。在ST液中加入磷酸二酯酶抑制剂可以抑制心肌细胞和血管平滑肌细胞型磷酸二酯酶的活性，提高心肌细胞cAMP的水平，激活肌浆网钙泵的活性，促进肌浆网对Ca2+摄入3。肌浆网对Ca2+摄入的增加也相应地增加了细胞质Ca2+的浓度，这可能是磷酸二酯酶抑制剂提高峰收缩压、降低舒张

6、压和改善心功能的原因。在ST液中加入CAPE（Caffeic acid phenethyl, CAPE），可以提高心肌抗氧化的能力，对抗缺血再灌注损伤4。    1.3  HTK液（histidine-tryptophan-ketoglutarate solution）      HTK液是由 Bretschneider 于1975年创制的，并于1979年用于心脏手术，1985年德国心脏外科界应用作为心肌保存液成功地进行了心脏移植手术, HTK液也先后成功地应用于肾、肝脏、胰腺的移植。其组成特点：(1)含

7、钾量低；(2)含组氨酸/组氨酸盐缓冲系统，有较强的缓冲能力，组氨酸为有效的非渗透性因子，可防止内皮细胞肿胀；(3)含色氨酸，作为膜稳定剂，可防止组氨酸进入细胞内；(4)含甘露醇，作为羟自由基的清除剂，可防止氧自由基的损伤，同时兼有渗透支持的作用；(5)含- 酮戊二酸及色氨酸，作为高能磷酸化合物的底物； HTK液粘度低，易于扩散至组织间隙，也易于在短时间内让器官降温5。    1.4  Celsior液（Celsior solution）  Celsior 液是一种非永久性、稳定的、含乳糖酸和甘露醇及组氨酸缓冲系统的高渗性保存液, 高钠低钾是其主

8、要特点。    2  钾离子开放剂（PCOs）    2.1  钾离子开放剂的研究进展  最近大量文献报道，添入钾离子开放剂的器官保存液在引起心脏停搏同时，几乎不会产生再灌注后心律失常和心肌收缩功能的异常，还可以显示出较好的心肌和冠状动脉保护效果68。目前应用的钾离子开放剂：nicorandil；pinacidil；diazoxide。    2.2  高钾对心肌细胞的损害  高K+（UW液，K+138mmol/L）器官保存液在引起心脏停跳的同时，可引起心

9、肌细胞内离子的紊乱2。细胞外液K+浓度升高干扰了Ca2+的内流，导致Ca2+的内流延缓，兴奋-收缩耦联受到一定影响。术后再灌注复跳后，可引起心肌收缩功能的异常。再灌注时，高K+还可以引起各种类型的心律失常，严重影响了移植心脏的功能。基于以上原因，临床上一般不用高K+的器官保存液保存心脏。    2.3  钾通道开放剂在心脏保存液中的应用及机制  在4条件下，将二氮嗪（diazoxide，一种线粒体KATP通道开放剂）加入器官保存液，用这种保存液保存离体大鼠心脏10h，复灌注后，实验组心肌细胞明显减少了心肌酶(乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶及谷草转氨酶

10、) 的漏出量，对心肌细胞超微结构也有较好的保护作用，再灌注后反映了心功能的指标（左心室舒张末期压力、心率、左心室逐渐产生的压力、左心室压力变化率、冠脉流出量）恢复高于对照组6。二氮嗪保护心肌的可能机制为：通过降低线粒体外膜的通透性，减少细胞色素C的释放，防止线粒体嵴的变形，保存线粒体结构的完整，从而保护了线粒体的正常功能（如复合体维持线粒体内细胞色素C的隔离，维持心肌细胞内ATP的浓度）6,7。雷怕霉素是一种抗真菌药，实验显示它能缺血再灌注后大鼠心肌的梗死面积8。雷怕霉素诱导线粒体KATP通道开放的机制可能为：雷怕霉素与mTOR （mammalian target of rapamycin 雷

11、怕霉素结合位点）结合，可以补偿地增加上游激酶如PI-3K（phosphatidylinositol-3 kinase 磷脂酰肌醇-3-激酶）和AKt，这些激酶在激活线粒体KATP通道时是非常重要的8。另外，线粒体区域化间隙内的mTOR允许生理性地开放线粒体KATP通道。雷怕霉素还可以通过上调NO的水平，从而开放线粒体KATP通道8 。以上研究提示，不论钾离子开放剂，还是通过其他一系列信号转导最终开放线粒体KATP通道的药物（如雷怕霉素开放线粒体KATP通道过程）都具有心肌保护作用。 线粒体KATP通道的开放保护心肌可能机制为：通过开放线粒体KATP通道，减少再灌注或再氧合时活性氧（reacti

12、ve oxygen species ,ROS）的产生68。而其具体机制需进一步阐明，但钾离子开放剂替代高K+加入器官保存液的优点已有很多相关文献报道。然而，加入何种钾离子开放剂、加入剂量为多少，还需进一步的体内外实验和大量的临床实验来确定。    3  加入器官保存液中的能量物质    3.1  心肌细胞对能量的特殊要求  心脏为高能量依赖器官, 心脏功能发挥需要持续的能量供应, 但心肌本身并不储存能量, 心脏在缺血保存时，线粒体由于缺少代谢底物而减少了ATP生成。导致生物膜主动转运因缺乏ATP而不能正常

13、运转，导致心肌细胞内离子的紊乱、代谢底物的缺乏和生化反应的异常，引起心肌细胞的损伤。    3.2  现有心脏保存液中能量物质的应用  已有的器官保存液中加入的能量物质为： UW液中35.83g/L乳糖酸，ST液中28g/L乳酸酯，HTK液中1g/L 2-酮戊二酸，Celsior液中20g/L谷氨酸9。然而这些添加剂需心肌细胞经一系列的生化反应最终生成ATP，维持心肌细胞正常的代谢。    3.3  ATP脂质体的特殊作用分析  将ATP脂质体（ATP-Load liposomes,ATP-L）

14、直接加入Krebs液,显示出较好的保存效果。将ATP-L加入Krebs液， 用Langendorff灌注装置灌注离体的大鼠心脏，缺血再灌注后，可观测到实验组左心室舒张压（LVEDP）显著降低，很好地保护了心脏的舒张功能10。这可能是ATP-L在缺血期经扩散进入心肌细胞而提供了心肌细胞所需的能量，从而改善再灌注后细肌丝的机械功能。此外，用ATP酶处理后，仍有显著的心肌保护效应10，提示这种能量物质较稳定，有望作为一种添加剂。ATP-L与以往加入器官保存液的糖类物质或加入参与三羧酸循环的能量物质不同，它可将细胞可以直接利用的物质（ATP不稳定，很快会分解）以脂质体的形式加入保存液，并能在较长的时间

15、内发挥其功能。而是否能代替其他能量物质加入器官保存液，还需进一步的体内外实验和临床实验。    4  腺苷及肌苷保护心肌的机制    4.1  腺苷保护心肌的机制  腺苷是UW液的组成成分（1.34g/L）9。研究发现，腺苷的心肌保护作用是由A2AAR和A3AAR介导的11。保存液中加入A2AAR的激动剂，有明显的心肌保护作用，在应用腺苷时也能得到同样的结果。向犬齿和猪的冠状动脉内注入A2AAR选择激动剂CGS21680能有效地减少梗死面积，但在0.152.0g/(kg·min）的剂量范围内可导

16、致低血压或反射性心动过速11。另一项研究也证实，麻醉的狗在承受了90min LAD（左前降支）阻塞和2h再灌注后，静脉内输注A2AAR的激动剂ATL146e也能有效地减少心肌梗死面积12。当加入的剂量为较低剂量0.01g/（kg·min）时，没有改变心率、全身血压和冠状动脉血流量。这个研究给我们一个启示，可以选择出一种无血管作用的但能有效地减轻再灌注损伤的A2AAR激动剂，测定出合适的剂量作为添加剂加入保存液。A2AAR激动剂还可以抑制再灌注后的炎症反应12。A3AAR激动剂IB-MECA减少心肌再灌注损伤是通过减少MPTP（mitochondrial permeability tr

17、ansition pore,MPTP,线粒体通透性转化孔）的开放12。因为MPTP开放，导致线粒体内的细胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子（Apaf）和凋亡诱导因子（AIF）释放，从而诱导心肌细胞的凋亡。进一步阐明腺苷亚型受体介导的心肌保护作用，有望用特异性的腺苷亚型受体激动剂代替腺苷作为添加剂加入器官保存液，以期更好的心肌保护作用。    4.2  肌苷  肌苷（inosine）为腺苷的代谢产物，过去一直认为肌苷是一种不活泼的代谢产物，但最近发现肌苷对心肌具有保护作用。肌苷可以特异性地抑制PARSPoly（ADP-ribose）Polymerase

18、 synthetase激活和调控的细胞死亡13，14。在给 Lewis大鼠做腹腔心脏异位移植手术中，供心经历1h缺血保存。结果显示，加入肌苷的保存组，明显提高了再灌注早期心肌和冠脉内皮细胞功能的恢复，移植后还可以持续对抗再灌注诱导的移植心脏冠脉内皮细胞功能的异常13。在此实验中肌苷已经显示出了较好的应用前景，但这方面的研究较少，是否能像腺苷一样作为添加剂，还需进一步的实验。    5  缺血再灌注损伤机制    缺血再灌注（ischemia-reperfusion,I/R）损伤是胸部暴露手术中最常见也是最主要的损伤，尤其是心

19、脏移植手术。I/R损伤的发生机制尚未完全阐明，目前认为与氧自由基生成和钙超载、白细胞激活有关。    6  减轻缺血再灌注损伤    缺血再灌注（ischemia-reperfusion,I/R）损伤是供体心脏要承受的最主要和最严重的损伤，若将以下能减轻I/R损伤的物质作为添加剂加入保存液，很可能延长供体心脏体外停留时间。目前减轻I/R损伤主要研究方面为减少ROS产生和减轻钙超载；此外缺血预处理（ischemia preconditioning, IPC）和多次短暂缺血预处理均能减轻I/R损伤，虽然这两种预处理对心脏移植中几

20、乎不可能应用，但其减轻I/R损伤的机制对器官保存液研究有所提示。    6.1  减少ROS产生      已有的几种器官保存液中，减少ROS损伤的添加剂大多数为ROS消除剂（UW液中0.922g/L谷胱甘肽，Celsior液中还原型谷胱甘肽、组氨酸和甘露醇）9。但在减少ROS损伤方面，减少ROS产生优于清除ROS。    减少线粒体的氧化作用中ROS生成和中性粒细胞（PMN）ROS生成、提高NAD+的水平和增强心脏抗氧化功能，均能减轻I/R损伤。此外，抗氧化剂可防止I/R诱

21、导的心肌凋亡，减轻I/R损伤，黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase , XO）抑制剂也可减轻自由基损伤。    6.2  减轻钙超载  Na+ /H+交换蛋白抑制剂减轻氧化应激造成的心肌细胞损伤，提高心肌的收缩功能，抑制心肌细胞质和线粒体Ca2+浓度的升高，降低乳酸脱氢酶的释放，增加组织ATP、磷酸肌酸和糖原的含量2224。Na+/Ca2+交换蛋白抑制剂可对抗缺血再灌注引起的钙超载，还可以减轻钠超载，减少心肌酶的释放，提高再灌注后的心脏功能，增加再灌注后冠脉血流量，提高再灌注后高能磷酸化合物和ATP的恢复25， 26。以上都是不同抑制

22、剂综合的心肌保护作用，但作为添加剂加入器官保存液，需要选择一种副作用小，心肌保护作用强的抑制剂。此外，麻醉预处理也能减轻钙超载，其作用机制与Na+/Ca2+交换蛋白抑制剂不重叠，与Na+/Ca2+交换蛋白抑制剂联合应用时心肌保护作用强于单独应用Na+/Ca2+交换蛋白抑制剂27。    7  心脏内源性保护机制    缺血再灌注期，心脏的红细胞生成素受体系统、阿片类受体系统和内源性降钙素基因相关肽受体激活均具有心肌保护作用。    7.1  红细胞生成素-红细胞生成素受体系统 

23、; 红细胞生成素受体不仅存在于血细胞系细胞，而且还存在于心脏。小鼠承受了30min左冠状动脉阻塞后再通24h后，结果显示RES（一种基因缺陷的小鼠，红细胞生成素受体仅存在于血细胞系）心肌梗死面积远大于WT（正常的小鼠），提示内源性的非血细胞的红细胞生成素-红细胞生成素受体系统在缺血再灌注损伤时具有重要的心肌保护作用29。重组的人源红细胞生成素 (rhEPO)可以极大减轻I/R诱导的NF-B和AP-1激活，减少了TNF-、IL-6和ICAM-1的产生，但提高了IL-10的水平。rhEPO减少I/R损伤，其机制可能与rhEPO的抗炎性质有关30。另一项研究显示，EPO的保护心肌对抗I/R损伤的机制

24、可能为激活ERK 和PI-3K旁路，此旁路激活在对抗I/R损伤中起着重要的作用31。    7.2  阿片类-阿片类受体系统  心脏有能力合成和释放三种主要阿片类活性肽，包括脑啡肽、内啡呔和强啡肽，也存在类阿片活性肽受体（、）。实验显示类阿片受体激活剂有心肌保护作用，其主要保护效应是由受体介导的32。再灌注后，减轻心肌损伤主要与激活阿片受体介导的抗凋亡促生存激酶信号旁路有关33。研究显示在冠状动脉阻塞前或阻塞再通5min后，给予阿片受体激动剂BW3T3U86或不可逆受体激动剂酚酞尼异硫氰酸酯（Fentanylisothiocyanate），能同

25、效地减小经历30min冠脉阻塞2h再灌注后心肌的梗死面积33。    7.3  内源性降钙素基因相关肽（Calcitonin  gene-related peptide ,CGRP ）  内源性降钙素基因相关肽可诱导预处理样心肌保护功能，因为在大鼠心脏冠脉阻塞前5min直至再灌注结束注入CGRP，可明显减小心肌梗死面积。在离体心脏的再灌注中，CGRP可作为一种冠状动脉舒张剂，无快速耐受性。CGRP受体阻断剂BIBN4096BS可以减少冠脉的基础流量，说明CGRP在调解冠状动脉的收缩和舒张时起着重要的作用。缺血预处理心肌保护作用与内源性

26、CGRP释放增加有关，而外源性CGRP可以模拟预处理的心肌保护作用。缺血预处理和外源性CGRP的作用可以被BIBN4096BS取消，为降钙素基因肽的心肌保护作用提供了足够的证据34。CGRP对心肌的作用似乎矛盾，但大多数实验支持CGRP有心肌保护作用，是否CGRP介导心肌保护作用需进一步的实验，以决定它是否能作为添加剂加入保存液。    8  结语    延长体外离体心脏的保存时间，不可避免地加长了缺血时间，再灌注损伤必然也会因此而加重，心肌所需的能量将会严重匮乏。进一步阐明缺血再灌注损伤的机制，减少I/R损伤；寻找有效的能

27、量物质（如ATP-L），对提高心脏移植的成功率非常关键，保存液的研究也应在这方面取得突破。【参考文献】  1 鲁可权. 心脏保存液研究进展. 山东医药, 2004, 44 (33): 68-69. 2 Rupak Mukherjee, William M. Yarbrough, Emily S. Reese, et al. Myocyte Contractility With Caspase Inhibition and Simulated Hyperkalemic Cardioplegic Arrest. The Society of Thoracic Surgeons, 2004

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