仙鱼汤对小鼠Lewis肺癌的作用研究

1、仙鱼汤对小鼠Lewis肺癌的作用研究        【摘要】    【目的】探讨具有健脾清肺、化痰祛瘀作用的中药复方仙鱼汤对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用及其相关的分子机制。【方法】将50只Lewis肺癌荷瘤小鼠分为仙鱼汤高、中、低剂量组(剂量分别为1.747、0.874、0.437g·kg-1·d-1),环磷酰胺(CTX)组(剂量为20mg·kg-1·d-1),荷瘤模型组;计算各组小鼠平均瘤体质量及抑瘤率;制备单细胞悬液,采用流式细胞仪检测各组小鼠Le

2、wis肺癌细胞周期、细胞凋亡率;采用免疫组化法检测各组Lewis肺癌小鼠的bcl2基因的表达。【结果】仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组瘤体质量均低于模型组,肿瘤细胞凋亡率均高于模型组(P<0.05或P<0.01),仙鱼汤各组随着药物剂量的增大,抑瘤率和肿瘤细胞凋亡率逐渐增加。仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组处于S期的细胞比例均低于模型组(P<0.05或P<0.01),呈现明显的G0/G1期阻滞现象。仙鱼汤各剂量组bcl2染色强度指数显着低于模型组(P<0.01)。【结论】仙鱼汤具有抑制小鼠Lewis肺癌生长的作用,其机理可能与通过降低bcl2表达从而促进肿瘤细胞凋

3、亡有关。     【关键词】  仙鱼汤/药理学 肺肿瘤/中药疗法 细胞凋亡 基因表达调控 细胞培养    肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一,中医药在肺癌的治疗中发挥着越来越重要的作用。仙鱼汤是治疗肺癌的经验方,具有健脾清肺、化痰祛瘀之功效,多年的临床应用已证实其具有较好的临床疗效1-2。本研究通过动物实验,进一步研究了仙鱼汤对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用,并从诱导肿瘤细胞凋亡及调控凋亡相关基因的角度探讨其作用机理。现报道如下。    1  材料与方法  &#

4、160; 1.1  动物  C57BL/6J小鼠,雌雄各半,体质量1822g,SPF级,由广州中医药大学实验动物中心提供(合格证号:0020535)。    1.2  瘤株  小鼠Lewis肺癌细胞株由中国医科大学肿瘤研究所提供,广州中医药大学第一附属医院中医肿瘤研究所长期移植传代。    1.3  药物与制备  仙鱼汤组成:仙鹤草15g,鱼腥草30g,猫爪草30g ,山海螺30g,党参15g,三七片10g,山慈菇10g,浙贝母15g,守宫5g,天冬15g,黄芪30g,炙甘草

5、5g。由广州中医药大学新药研究中心制备,按照传统煎煮法煎煮,低、中、高剂量组药物浓度根据人与动物体表面积与计量换算法计算3,低剂量组1.092g/mL,中剂量组2.184g/mL,高剂量组4.368g/mL,分别相当于临床等效剂量的1、2、4倍。制备后于4冰箱中贮存备用。环磷酰胺(CTX)注射用粉针剂为山西普德药业有限公司产品(批号:20060206),200mg/支,临用前用生理盐水溶解,稀释浓度为2mg/mL,根据CTX的半数致死量(LD50)为472mg/kg,注射用量为LD50的1/31/5,故小鼠给药剂量设为20mg·kg-1·d-1。  &#

6、160; 1.4  主要试剂与仪器  碘化丙啶(PI)染液为晶美生物工程有限公司产品;bcl2兔多克隆抗体、即用型过氧化物酶免疫组织化学染色(SABC)试剂盒(SA1022)均为博士德生物工程有限公司产品;RPMI1640培养基为Gibco公司产品;二甲苯、乙醇,均为市售分析纯;超净工作台(苏净集团安泰公司);冷冻桌面离心机(Eppendorf 5810R Centrifuge);解剖显微镜(北京电子光学设备厂);37电热恒温水浴箱(上海恒丰仪器仪表有限公司);ALTRA型流式细胞仪(美国Beckman coulter公司);CS型烤片机(孝感市电子仪器厂);亿鸣200病理

7、图像分析系统(中国亿鸣)。    1.5  Lewis肺癌荷瘤小鼠模型复制  于液氮罐中取出Lewis肺癌细胞株1支,置于37电热恒温水浴箱内,轻轻摇动令其尽快融化。取出冻存管,用酒精消毒后开启,用吸管吸出细胞悬液,注入离心管并滴加体积分数10%小牛血清RPMI16402阳性表达检测  采用免疫组化法。常规石蜡包埋后,4m厚连续切片,行SABC法免疫组织化学染色,用PBS液代替一抗做阴性对照。光学显微镜下观察,bcl2蛋白染色细胞浆呈棕黄色为阳性。在高倍镜视野(400)下随机计数5个视野。计算出各组的染色强度指数(staining i

8、ntensity index ,pSII)。pSII=(pA强度瘤细胞×0)+(pB强度瘤细胞×1)+(pC强度瘤细胞×2)+(pD强度瘤细胞×3)。其中A强度代表细胞浆无特异性染色;B强度代表细胞浆呈特异性浅棕黄色,染色较浅;C强度代表细胞浆呈特异性棕黄色;D强度代表细胞浆呈特异性深棕色,染色较深。染色强度指数(pSII)的范围在03 6。    1.8  统计学分析  采用SPSS 11.5统计软件处理。    2  结果    2

9、.1  一般状况的观察  实验结束后,模型组、CTX组小鼠表现为身体瘦小,活动少,喜聚群,毛发缺少光泽;CTX组小鼠于实验57d开始出现脱毛,进食减少;仙鱼汤高、中、低剂量组小鼠脱毛现象少于CTX组及模型组,活动力优于CTX组及模型组。    2.2  各组抑瘤率比较  表1结果表明,仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组瘤体质量均低于模型组(P<0.05或P<0.01)。各仙鱼汤组随着药物剂量的增大,瘤体质量逐渐减轻,抑瘤率逐渐增高。    表1  各组Lewis肺癌小鼠的瘤体

10、质量及抑瘤率比较(略)    Table 1  Comparison of tumor mass weight and tumorinhibitory rate in different groups    统计方法:单因素方差分析;P<0.05,P<0.01,与模型组比较    2.3  各组细胞凋亡率及细胞周期分析  仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组小鼠Lewis肺癌细胞凋亡率均高于模型组(P<0.05或P<0.01),各仙鱼汤组随着剂量的增大,凋

11、亡率亦逐渐增加。仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组处于G0/G1期细胞的比例均高于模型组,其中仙鱼汤高剂量组、CTX组与模型组比较,差异有显着性意义(P<0.01)。仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组处于S期细胞的比例均显着性低于模型组(P<0.05或P<0.01),呈现明显的G0/G1期阻滞现象。仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组处于G2/M期细胞的比例与模型组比较,差异无显着性意义(P>0.05)。结果见表2、图1。    2.4  光镜观察  模型组癌细胞大小和形态很不一致,可见瘤巨细胞;癌细胞核体积增大,细胞核和细胞浆

12、比例增大,核的大小、形状、染色不一,可见巨核、多核,核染色深,核染色质呈粗颗粒状,分布不均匀;核仁肥大,数目增多,核分裂相增多,可见不对称性、多极性及顿挫性等病理性核分裂相,间质内淋巴细胞少见(图2-a)。CTX组可见大片坏死,间质见较多的淋巴细胞等炎细胞浸润,纤维组织反应性增生(图2-b)。仙鱼汤各剂量组可见癌巢内坏死面积增大,间质可见淋巴细胞等炎细胞浸润,可见较多的细胞凋亡小体(图2-c、d、e)。    2.5  各组bcl2染色强度指数  凋亡相关基因bcl2的阳性产物主要位于细胞浆,可见大量的细胞浆棕黄色颗粒染色。仙鱼汤各剂量组bcl

13、22阳性表达比较(免疫组化,×400)(略)    Figure 3  Positive expression of bcl2 in different groups detected by immunohistochemical method    表3  各组bcl2染色强度指数比较(略)    Table 3  Comparison of staining intensity index of bcl2 in different groups 

14、60;  统计方法:单因素方差分析;P<0.01,与模型组比较    3  讨论    多数学者认为,肺癌发生发展的中医病机可以用"痰、瘀、虚"3个字高度概括。其中正虚是肺癌发生的基础,医宗必读云:"积之成者,正气不足,而后邪气踞之。"正虚又以脾虚为主,"脾为生痰之源,肺为贮痰之器"。正是脾虚导致痰浊内生,进一步血停成瘀,瘀血内生,痰瘀内阻,蕴积肺部,日久而发为本病。    广州中医药大学陈锐深教授从肺癌病因病机出发,以

15、健脾清肺、化痰祛瘀为治疗    大法,自拟了治疗肺癌的经验方"仙鱼汤"。方中君药为党参,具有补中益气、健脾益肺、生津养血的功效,为补益肺脾气之要药。黄芪配合党参,以补肺脾之气;浙贝母清热化痰、开郁散结;猫爪草散结消肿;三七片化瘀散结止痛,共为臣药。仙鹤草收敛止血、解毒抗癌;鱼腥草清热解毒、消痈排脓;天冬养阴清肺生津;山海螺解毒消肿、排脓祛痰;山慈菇清热解毒、化痰消肿散结;守宫散结止痛,共为佐药。炙甘草调和诸药,为使药。综合全方,扶正祛邪,攻补兼施,使祛邪而不伤正,共奏健脾清肺、化痰祛瘀之功效。    肿瘤的发生和发

16、展不仅与肿瘤细胞的增殖、分化异常有关,而且与细胞凋亡的调控失常有关。人类细胞的凋亡机制十分复杂,目前已鉴定出了构成凋亡途径的多种成分,揭示出凋亡是受多种基因调控的,例如p53、p16、cmyc、bcl2、bax等相关基因均参与了细胞凋亡的调控7。bcl2是一种凋亡相关基因,被激活的bcl2基因的主要作用是抑制细胞凋亡,下调bcl2基因的表达,对肿瘤细胞有显着的生长抑制作用。bcl2可能通过阻断凋亡的公共信号传递通路(如抑制线粒体释放细胞色素C)达到抑制或阻断多种细胞及细胞系的细胞凋亡过程。随着该基因蛋白产物的过度表达,使得细胞增殖与凋亡的平衡发生紊乱,从而阻断细胞凋亡的最后共同通道,从而抑制细

17、胞凋亡,导致癌变8-11。    本研究通过动物移植性肿瘤实验法探讨仙鱼汤对Lewis肺癌生长及肿瘤细胞凋亡的作用。结果表明,仙鱼汤具有一定的抗肿瘤作用,而且其抑瘤作用随着剂量的增加而增强。从HE染色的病理切片中发现,不同剂量仙鱼汤组可见癌巢内坏死面积增大,间质可见较多的淋巴细胞等炎细胞浸润,可见较多的细胞凋亡小体。进一步采用流式细胞仪检测凋亡率,结果表明仙鱼汤具有促进小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的作用,并且随着剂量的增加作用也逐渐增强。仙鱼汤各剂量组处于G0/G1期细胞的比例均高于模型组,处于S期细胞的比例均低于模型组,呈现明显的G0/G1期阻滞现象,提示仙鱼汤可

18、能使G1期细胞不能通过细胞周期检测点进入S期,从而发生G0/G1期阻滞,阻断DNA复制,干扰肿瘤细胞周期正常进行,以起到抑制肿瘤的作用。免疫组化检测结果显示,仙鱼汤各剂量组bcl2蛋白表达均显着低于模型组,并随着仙鱼汤剂量的加大,肿瘤组织bcl2的染色强度指数也逐渐降低。本研究实验结果提示仙鱼汤可能通过降低bcl2表达的途径促进肿瘤细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用,对临床用药具有一定的指导意义。     【参考文献】    1李穗晖,陈锐深,吴玉生,等.仙鱼汤治疗中晚期原发性支气管肺癌40例疗效观察J.新中医,2006,38(9):26.

19、    2王坤,王俊.中医药治疗肺癌90例临床观察J.黑龙江中医药,1994(2):12.    3马超英.实验中医学基础M.北京:中国协和医科大学出版社,2000:279.    4陈奇.中药药效研究思路与方法M.北京:人民卫生出版社,2005:1001.    5Li Huschtscha W A,Bartuier C E,Anderson R,et al.Characteristics of cancer cell death after exposure to cytotoxic drugs in vivoJ.Br J Cancer