吉姆萨染色法对大脑组织凋亡细胞的染色

1、于4孵育过夜。然后分别用FITC标记的山羊抗小鼠Ig G及罗丹明标记的山羊抗小鼠Ig G抗体(北京中山生物技术有限公司孵育1h。随机选取20个视野于荧光显微镜下观察,免疫荧光染色阳性细胞为心肌细胞,计数并摄像。同一视野于普通光条件下计数细胞总数,计算心肌细胞纯度。2结果2.1细胞存活率测定台盼蓝染色观察仅5%细胞着色,细胞存活率达95%以上。2.2心肌细胞形态学观察刚接种的心肌细胞尚未贴壁,呈圆形,悬浮于培养液中。812h换培养液时,部分心肌细胞已贴壁生长,并出现自发性搏动,搏动频率较慢,有的每分钟仅数次。24h后观察细胞已全部贴壁,贴壁后为梭形,菱形或多角形(图1,90%开始搏动。继而细胞逐

2、渐在皿底表面铺展,并伸出伪足,形成不规则的星形并相互接触交织成网,在培养第48h可形成呈放射状排列的细胞簇(图2,其搏动已同步化,每分钟120次左右。培养90d仍可见到成团搏动的心肌细胞。2.3心肌细胞纯度鉴定分别用心肌特异性M HC/、Tn I 抗体免疫荧光检测均证明心肌细胞纯度达95%以上,并可见明显的心肌特异性横纹结构(图3,图4。3讨论3.1消化过程是影响心肌细胞存活率的重要因素胰蛋白酶可分解组织间质的蛋白成分,但对肌细胞膜蛋白亦起较强的破坏作用1,故对其作用时间和浓度的要求较为严格。而每次实验都可能有细微差别,所以应结合肉眼观察消化情况及时终止消化,不宜固定精确的消化时间。胶原酶可消

3、化细胞间质的胶原纤维以释放细胞1,作用较缓和,对细胞损伤较小。本实验室的多年经验认为单一使用胰蛋白酶消化对细胞损伤大,联合使用胶原酶将胶原纤维充分消化后利于离心时细胞沉淀,提高心肌细胞存活率,细胞贴壁早,搏动出现亦早。第一次消化时间以35min为宜,主要是去除一些血细胞、从组织边缘消化下来的坏死心肌细胞及其细胞碎屑,时间不易太长,否则会丢弃一些已消化下来的心肌细胞。终止消化后的消化产物应立即离心后重悬于培养液以使受损的细胞尽早恢复。消化过程中我们强调反复吹打,因为吹打能使酶与组织充分均匀接触,减少消化次数和时间,提高细胞存活率。每次消化产物并不彻底,需反复吹打使心肌细胞呈单个分散状态再终止消化

4、。吹打不充分细胞团块占5%以上会大大降低心肌细胞的收获率,并且从团块中爬出来的成纤维细胞影响心肌细胞的生长和纯度。3.2尽可能多的去除成纤维细胞是提高心肌细胞纯度的关键成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁,采用差速贴壁的方法可去除大部分成纤维细胞。差速贴壁时间以1h为最佳,与大部分文献报道6090min2,3一致。另外,我们于培养8 12h后换液将培养液中的细胞团块去掉并加入有丝分裂抑制剂丝裂霉素C(抑制成纤维细胞的DNA和蛋白合成以尽量减少自细胞团块中爬出来的成纤维细胞并抑制其生长,但操作时需小心谨慎,避免刚刚贴壁的心肌细胞随换液而被丢弃。加入溴脱氧尿苷4亦可达到抑制其增生的目的。3.3培养液是维

5、持细胞生存的基本条件心肌细胞在偏酸性环境中(p H值7.07.2更利于生长,培养液储存后p H值逐渐升高,最好现配现用。如培养液储存2周以上还应重新加入原量的谷氨酰胺,因为细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,而谷氨酰胺在溶液中易分解。抗生素的药效浓度与毒效浓度接近,对细胞可造成损害,实验中注意无菌操作可有效预防污染,故培养液中不加抗生素。如经费条件许可,前48h 可用胎牛血清培养,因胎牛血清较新生牛血清含有更多的生长调节因子和营养成分,初次分离的心肌细胞在此环境中生长更好。图版说明(图见插4图124h后,贴壁的心肌细胞呈梭形、菱形或多角形,×200.图248h后,心肌细胞形成呈放射状排

6、列的细胞簇,×200.图3抗心肌特异性M HC抗体免疫荧光染色,二抗为FITC标记的山羊抗小鼠Ig G,×400.图4抗心肌特异性Tn I抗体免疫荧光染色,二抗为罗丹明标记的山羊抗小鼠Ig G,×400.参考文献6182636.2Suzuki T,Ohta M,Hoshi H.Serum2free chemically defined medi2 um to evaluate t he direct effect s of growt h factors and inhibitors on proliferation and function of neonata

7、l rat cardiac muscle in culture.In vit ro Cell Dev Biol,1989,25(7:6012606.3Bes S,Roussel P,Laubriet A,et al.Influence of deep hypot herm2 ia on t he tolerance of t he isolated cardiomyocyte to ischemia2reper2 fusion.J Mol Cell Cardiol,2001,33(11:197321988.4Simpson P,Savion S.Differentiation of rat m

8、yocytes in single cell cultures wit h and wit hout proliferating nonmyocardial cells.Circ Res,1982,50(1:1012116.吉姆萨染色法对大脑组织凋亡细胞的染色徐广有1张翠香1冯化杰1孟庆辉2(齐齐哈尔医学院,1微形态实验室,22000级检验系本科生,齐齐哈尔161042根据资料记载凋亡细胞的染色可以用吉姆萨染色法1,但具体的操作方法却未见报道。我们根据吉姆萨染料染血涂片的原理,将其用于大鼠大脑海马区细胞的染色,探索出其染色程序,发现染色效果优于常规H E染色,核仁和凋亡细胞着263色清晰,细胞

9、与背景对比明显。现介绍如下:1试剂配制2分别量取吉姆萨染料粉剂0.75g、甘油50ml、甲醇50ml。将粉剂放于甘油内搅匀,放入60温箱24h,经常摇匀,取出待冷再加甲醇混匀,配成原液,封闭棕色瓶保存。使用时以原液10ml加入p H为6.46.8的磷酸盐缓冲液100ml稀释成工作液。磷酸盐缓冲液的配制:A液Na2HPO40.946g,蒸馏水100ml;B液KH2PO40.907g,蒸馏水100ml。临用时取A 液40ml,B液60ml混合,p H值约为6.64。2染色步骤所用材料为大鼠的大脑。具体操作步骤为:(1常规脱蜡至水;(2蒸馏水洗;(3在37温箱中吉姆萨染色30min;(4蒸馏水洗2m

10、in;(5PBS分色适度;(6将切片从PBS中拿出,甩掉切片上的水分,放在空气中略干燥,以肉眼观察组织上的水分消失为度;(7入100%酒精中30s至1min;(8二甲苯透明5min;(9中性树胶封片。3结果背景淡蓝色,核为深蓝色,凋亡细胞为深蓝色(附图。4体会这种染色方法是我们仔细研究了血涂片的染色方法和经过多次实验总结出来的。在染色中第6步是关键,我们曾尝试不经过此步骤直接入100%酒精脱水,但脱色严重,无法控制,使染色失败;我们也曾尝试在第6步后入95%的酒精中脱水,脱色也非常快,使染色未能成功;最后我们采取将切片从PBS中拿出,甩掉切片上的水分,放在空气中略干燥,以肉眼观察组织上的水分消

11、失后再入100%酒精脱水,效果良好。因此,用吉姆萨染料染大脑细胞以其操作简便、色彩鲜艳、对比度好、细胞核和凋亡细胞着色清晰,能够长期保存、不褪色,为一种值得推广的方法 。附图大鼠海马细胞参考文献1 王伯,李玉松, 两种染色方法对脑垂体三种嗜色细胞显示效果的比较柳洁马晓健(怀化医学高等专科学校基础医学部,怀化418000脑垂体由腺垂体和神经垂体两部分组成,其中腺垂体内有3种类型细胞:嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和嫌色细胞。在常规的苏木精伊红染色切片中,脑垂体3种嗜色细胞显示的效果一直不甚理想,学生在显微镜下进行观察辨认比较困难,为了更清晰地显示脑垂体3种嗜色细胞,我们采用不同的染色方法对脑垂体进行染色

12、,经过多次实验显示,采用Mallory 氏法染色,获得了较满意的染色效果,现介绍如下:1材料和方法1.1取材固定取成年雌狗脑垂体,Zenker液固定24h,自来水冲洗12h。1.2脱水、包埋与切片从体积分数为0.5的乙醇梯度上行至无水乙醇进行脱水,二甲苯透明,常规石蜡包埋切片,切片厚度为5m。1.3脱蜡、脱汞将组织切片浸入二甲苯中脱蜡,从无水乙醇下行至体积分数为0.7的乙醇,L ngol液脱汞,硫代硫酸钠、蒸馏水洗。1.4Mallory氏染色切片入0.1%酸性复红水溶液染5min。蒸馏水洗,入1%磷钼酸水溶液媒染5min,蒸馏水洗。切片入混合液(苯胺蓝0.5g,桔黄G2.0g,草酸2.0g,蒸馏水100ml染2min。蒸馏水洗,体积分数为0.95乙醇鉴别,上行至无水乙醇,二甲苯透明,中性树胶封固1。2结果嗜酸性细胞呈圆形或椭圆形,数量