半乳糖对大鼠骨髓间充质干细胞拟衰老作用的实验研究_图文

1、D2半乳糖对大鼠骨髓间充质干细胞拟衰老作用的实验研究邢玉芝杨玲麟林洪胡火珍王有为【摘要】目的探讨D2半乳糖(D2galacto se,D2gal诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞(m arrow m esenchym al stem cells,M SC s衰老后的形态学及生物学变化情况。方法取3只2月龄SD大鼠M SC s分离培养至第3代,一部分置于含8g L D2gal的培养液中继续培养至第6代作为诱导组;另一部分在原培养液中继续培养至第6代作为对照组,并作表型鉴定。采用流式细胞仪检测对照组加入8g L D2gal后4d内细胞周期的分布变化。两组M SC s培养7d并绘制生长曲线,在光镜和透射电

2、镜下观察其形态和结构变化,2半乳糖苷酶染色、单细胞凝胶电泳检测DNA损伤方法检测其衰老后的生物学行为变化。结果诱导组M SC s镜下呈典型的衰老细胞形态;对照组M SC s形态均匀,长势良好。流式细胞仪检测表明加入D2gal诱导后90%M SC s停留在G0 G1期,而S期和G2 M期M SC s趋于消失,并随诱导时间延长趋势越明显;对照组M SC s各期比例正常。M SC s生长曲线示诱导组生长速度较对照组明显减慢。诱导组约85%呈2半乳糖苷酶阳性染色,对照组染色为阴性。单细胞凝胶电泳示诱导组M SC s DNA有拖尾现象,对照组M SC s无DNA损伤。结论D2gal对SD大鼠M SC s

3、的老化具有诱导作用,初步推断8g L为最适浓度,为研究M SC s衰老提供了较好的模型。【关键词】D2半乳糖骨髓间充质干细胞细胞衰老大鼠中图分类号:R318Q813文献标识码:ACorresp ond ing au thor:H U H uoz hen,E2m a il:huhuoz hen163.co m【Abstract】ObjectiveTo study mo rpho logical and b i o logical senescence changes induced by D2galacto se in the cu ltu red rat m esenchym al stem

4、cells.M ethodsA fter3rd generati on s cu ltu red in the DM E M2F12,M SC s w ere changed in to DM E M2F12m edium con tain ing8g L D2galato se and cu ltu red to the6th generati on s as the inducem en t group.T he comparison w ere the6th generati on s w h ich w as cu ltu red in the DM E M2F12m edium al

5、l along,and then inden tified by su rface w ave.U sing flow cytom eter to check the comparison s cell cycle change after s w ing in w ith8g L D2galato se w ith in the4days.In the first7days to draw the grow th cu rve to the tw o group s.Op tical and electron ic m icro scope w ere u sed to iden tify

6、the influences of characteristic mo rpho logical of m esenchym al stem cells of the tw o group s,the influences of b i o logical m arkers w ere iden tified by single cell gel electropho resis and2galacto se dye.ResultsA fter treatm en t w ith D2galacto se,the m esenchym al stem cells disp layed mo r

7、pho logical and b i o logical changes in the cell senescence w ith the senescen t characteristic mo rpho logicalm arkers;85%of the cells w ere X2gal dye m ascu line,and the singal cell gel electropho resis show ed DNA dam n ificati on.T he flow cytom etry show ed that90%of the cells stayed in G0 G1,

8、bu t the cells in S and G2 M al mo st disappeared.How ever,the cells in the con tro l group had no such DNA dam ages.ConclusionD2galacto se can induce senescence of the m esenchym al stem cells,and8g L is the best concen trati on to do so.T h is study has p rovided a good model fo r the research of

9、the m esenchym al stem cells senescence.【Key words】D2galacto seM arrow m esenchym al stem cellsCell senescenceR at正常细胞体外培养时,随传代数的增加,细胞的增殖能力逐渐丧失,当不能再进行有丝分裂时,达到其生长极限而成为衰老细胞1。骨髓间充质干细胞作者单位:四川大学生命科学学院细胞生物学教研室(成都, 610064通讯作者:胡火珍,教授,硕士导师,研究方向:衰老细胞的分子机制及干细胞研究,E2m ail:huhuozhen (m arrow m esenchym al stem ce

10、lls,M SC s作为目前骨组织工程中重要的种子细胞224,其体外培养也随着传代的增加而衰老,这对组织工程的构建将产生不利影响,需要我们进行有效监控。D2半乳糖(D2 galacto se,D2gal可作为一种致老剂,能诱导细胞及整体动物衰老5,6,但能否致M SC s衰老则罕见报道。因此我们拟初步建立一种M SC s的体外培养衰老模型体系,旨在探讨D2gal对M SC s拟老化作用的影响,为抗组织工程种子细胞衰老提供依据。1材料与方法1.1实验动物及主要试剂2月龄雄性SD大鼠3只,体重160185g(四川大学实验动物中心提供。DM E M2F12培养基、X2Gal染色剂(Sigm a公司,

11、美国,小牛血清(成都生物制品有限公司,Perco ll分离液(1.073g mL,Pham acia公司,美国,M T T、胰酶(Gibco公司,美国,D2gal(上海伯奥生物技术有限公司,DM SO(成都化学试剂厂,低熔点琼脂糖和正常熔点琼脂糖(O xo id公司,英国, CD142PE CD452F ITC、CD442F ITC、CD342F ITC CD452Percp、CD1052F ITC,CD292PE(Pharm ingen公司,美国。1.2M SC s体外分离培养SD大鼠断颈处死后无菌操作,取双侧股骨和胫骨,剔除周围肌肉组织,剪去两骺端,抽取5m l无血清DM E M2F12培

12、养基(含青霉素、链霉素各100U m l冲洗骨髓腔,吹打制成单细胞悬液,注入含有5m l Perco ll分离液离心管中,离心半径8c m,2000r m in 离心20m in,收集离心液界面上乳白色云雾状的细胞层,先后以PB S和DM E M漂洗,用含15%小牛血清DM E M2F12培养基重悬细胞,计数35×105个 m l 后即接种于培养瓶中,置于37、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中进行原代培养。分别于1、3d半换液,以后每3天全量换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞培养全过程。13d后细胞长满瓶底80%时进行传代培养,以1×104个 m l终浓度传代。1.3M T

13、 T检测细胞活力取第3代M SC s按1×105个 m l接种于96孔板,置5%CO2培养箱培养。培养接近融合时,换含不同浓度D2gal为0、4、8、12、16g L100l培养液,同时等体积PB S作空白对照组,每组做5个平行样品,3d后吸去培养液,PB S洗涤2次,每孔加入M T T(5m g m l 20l,继续培养4h,弃上清,加入150lDM SO振荡10 m in,用酶联免疫检测仪测定570nm的吸光度(A值。根据细胞存活率=(实验组-空白对照组 (对照组-空白对照组×100%计算细胞活力,选用8g L D2gal 建立M SC s衰老模型。1.4M SC s衰

14、老模型的建立取部分第3代M SC s改换在含8g L D2gal DM E M2F12培养液培养,继续培养至第6代,即为D2gal诱导的大鼠M SC s衰老模型,作为诱导组。另一部分在原培养液中继续培养至第6代作为对照组。1.5M SC s表型鉴定取对照组M SC s以0.25%胰酶消化后制成1×105个 m l的细胞悬液。室温下分别与荧光标记大鼠抗体CD142PE CD452F ITC、CD442F ITC、CD342 F ITC CD452Percp、CD1052F ITC、CD292PE混匀,孵育30m in,PB S洗涤2次,离心半径8c m,1800r m in 离心5m

15、in,弃上清,加入500l PB S中,各取6个样本,流式细胞仪检测。1.6检测项目3%戊二醛固定液,固定60m in,经脱水、包埋、超薄切片后透射电镜下观察。1.7统计学方法采用SPSS10.0软件统计包进行统计学分析,数据以均数±标准差表示。组间比较采用方差分析, P值<0105为有统计学意义。2结果2.1M SC s体外分离培养原代培养的M SC s于1d开始贴壁,细胞伸展成梭形、椭圆形或多角形;2d有细胞集落形成,贴壁细胞增多;4d呈典型的成纤维细胞形态;10d细胞集落不断扩大而融合成单层(图1。传代M SC s生长较原代快,7d即铺满培养瓶底,传代细胞保持原代细胞的形

16、态特征,随代数增加M SC s得到纯化,梭形细胞占90%以上(图2。诱导组M SC s形态及排列不规则,体积较大,胞浆区域增大,浆核的比例增加,胞浆中可见较多颗粒或空泡(图3。2.2M SC s表型鉴定由流式细胞表面标志鉴定可见,CD44、CD29、CD105为阳性表达,不表达造血细胞表面抗原CD14、CD34、CD45。2.3M T T检测细胞活力0、4、8、12和16g L组吸光度(A值分别为: 01241、0.230、0.201、0.136、01092g L,空白对照组为0.039g L;各组存活率分别为:96.70%±0.04%、84140%±0.02%、47.80

17、%±0.04%、26.40%±0103%及21.20%±0102%,组间比较差异有统计学意义(P<0105。根据存活率选用8g L D2gal建立M SC s的衰老模型。2.4流式细胞仪分析细胞周期8g L D2gal加入后大部分M SC s停滞于G0 G1期,S期及G2 M期趋于消失;对照组各期比例正常。培养14d M SC s,S期依次为11.4%、8.0%、7.1%及6.4%,明显低于对照组(S期38.8%,见表1。2.5M SC s生长曲线从细胞生长曲线可见,诱导组M SC s生长速度较对照组明显减慢。对照组最大增殖数约为4.9×105,对

18、数生长期在36d之间;诱导组最大增殖数约为718×104,对数生长期在47d之间(图4。2.62半乳糖苷酶染色于pH6条件光镜下可见诱导组85%的M SC s细胞质内为均匀的蓝色阳性染色,而对照组胞质内仍为无色均匀的雾状阴性染色(图5。表18g L D-gal培养M SCs不同时间细胞周期分析(%Tab.1Cell cycle analysis of M SCs treated by D-gal at differen t ti m es (%细胞周期Cell cycleG1G2S对照组Contro l group加入D2galT reated by D2gal2.7单细胞凝胶电泳观

19、察在经溴化乙锭染色的图像分析后可见,对照组M SC s无DNA损伤,其荧光在细胞内;诱导组M SC s DNA的断裂迁移出产生带有荧光的尾部(图6。2.8透射电镜观察诱导组M SC s呈典型的衰老形态和结构变化,核膜内折,核染色质浓缩,形成不同形状的块状;浆内存在大量空泡,线粒体数量减少,体积增大或肿胀,内质网扩张;但细胞膜保持完整(图7。对照组M SC s核膜平整光滑,染色质分布均匀,胞浆内可见丰富的线粒体(图8。3讨论3.1M SC s的生物学特点及表型鉴定体外扩增实验发现M SC s生长性状稳定,1、3、5代细胞的形态、生长曲线和贴壁率无显著差异;体外扩增容易、接种存活率高、适应能力强及

20、增殖速度快,所以作为研究干细胞衰老是一个很好的模型8。我们采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,再利用M SC s易贴壁生长的特性,通过连续传代获得较纯的M SC s。目前主要通过3种特征鉴定M SC s:体外培养贴壁生长呈梭形;一定条件下可向成骨、软骨、脂肪和成纤维细胞等细胞谱系分化,对上述成熟细胞进行功能鉴定;用特异结合M SC s细胞膜抗原的单克隆抗体直接鉴定9。但目前仍没有用于鉴定的理想标志性分子或方法,有学者10通过其表面分子的表达及多向分化潜能进行鉴定。我们选择了CD34、CD45、CD44、CD105、CD29抗原作表面标记。虽然M SC s与造血干细胞共同存在于骨髓中,但M S

21、C s不表达造血系统的标志,包括CD14、CD34及白细胞共同抗原CD45,但CD44却表达阳性。实验结果表明,所得细胞是骨髓中一群处于未分化状态的非定向干细胞,而且不是造血干细胞。3.2M SC s 衰老模型的建立依据在M T T 的检测实验中,可见中等浓度(8g L D 2gal 处理M SC s ,活力降低;而高浓度(16g L 的D 2gal 处理呈负增长,表明D 2gal 能使M SC s 增殖速度减慢,但D 2gal 浓度过高,会使细胞受到损伤,引起细胞的凋亡或死亡,所以我们初步选择8g L 的浓度进行诱导衰老。诱导传代3次后即建立了M SC s 衰老的研究模型。3.3M SC s

22、 衰老模型的鉴定参照近年来有关学者11,12提出的衰老生物学方面的一些指标,实验对模型进行了几个衰老生物学标志的鉴定。首先对M SC s 的动态学形态学观察,光镜下 图1M SCs 原代培养10d (×100图2传至第3代的M SCs (×100图3M SCs 诱导组(×250图4对照组与诱导组细胞生长曲线图5M SCs -半乳糖苷酶染色a 诱导组染色呈阳性(×200b 对照组染色呈阴性(×100图6M SCs 单细胞凝胶电泳图(溴化乙锭染色×400a 诱导组b 对照组图7M SCs 诱导组超微结构a 核膜内折(透射电镜×1

23、0k b 胞浆内大量空泡(透射电镜×10k c 脂核素颗粒(透射电镜×6k 图8M SCs 对照组超微结构(透射电镜×6k F ig .1RatM SCs cultured for 10days (×100F ig .2The 3rd passage of cultured rat M SCs (×100F ig .3M SCs i n the i nduce men t group (×250F ig .4Growth curves i n the con trol and the i nduce men t groups F ig

24、 .5-galactose dye of the M SCs a Po sitive 2galacto se dyeing of M SC s in the inducem ent group (×200b N egative 2galacto se dyeing of M SC s in the contro l group (×100F ig .6Si ngle cell gel electrophoresis of M SCs (Eth idiu m bro m ide sta i n i ng ×400a T he inducem ent group b

25、T he contro l group F ig .7Ultrastructure of M SCs i n the i nduce men t group a Inflexed karyo theca (T E M ×10k b L o ts of vacuo les (T E M ×10k c L i poch rom e (T E M ×6k F ig .8Ultrastructure of M SCs i n the con trol group (TE M ×6k 诱导组较对照组的形态及排列不规则,体积较大,胞浆区域增大,胞浆中可见较多颗粒或空

26、泡,有衰老表现;透射电镜观察细胞内发现染色质固化,核膜严重内折,线粒体明显减少并肿胀,内质网扩张,与细胞衰老的生理行为一致;胞浆内深色的圆形或椭圆形即为脂褐素,脂褐素是在胞浆中沉积随老年化过程而增加,也是细胞衰老的特征性标志。其次是对M SC s活力和增殖速度的影响,通过绘制两组M SC s的生长曲线可以看出,细胞老化的进程中生长速度逐渐变缓,提示细胞老化是各种因素的作用积累到一定程度,才发生增殖休止生长趋势的改变,诱导组M SC s生长速度较对照组的明显减慢。D i m ri和Pendergrass等13,14发现了细胞衰老的另一特征,体外培养人二倍体成纤维细胞在pH6时,2半乳糖苷酶染色的

27、阳性率随代龄增加而增加,他们将这种中性2半乳糖苷酶定义为衰老相关的2半乳糖苷酶。2半乳糖苷酶是一种常用的报告基因分子,通过原位染色,在普通的光学显微镜下就可以用于检测到2半乳糖苷酶的表达。诱导衰老的细胞中有85%细胞D2半乳糖苷酶染色阳性,表明该酶活性明显升高,是与衰老相关的。衰老是细胞脱离细胞周期并不可逆丧失增殖能力后进入的一种相对稳定的状态,是正常细胞的必然归宿。细胞周期变化可反映细胞的增殖能力,在流式细胞术检测细胞周期分布情况发现,正常的M SC s中仅有20%的静止细胞(G0 G1细胞,这表明M SC s具有强大的自我更新能力;而诱导组大多数的M SC s则停滞于G0 G1期,S期及G

28、2 M期M SC s趋于消失,表明M SC s分裂缓慢,增殖能力逐渐丧失。这与H ayflick发现人二倍体成纤维细胞在体外随传代次数的增加,逐渐丧失增殖能力而得到复制衰老的结果相似15。随着D2gal作用时间的延长,细胞周期中G0 G1比例增高,但非二倍体比例也显著升高,细胞周期中非二倍体比例的升高提示,D2gal对M SC s的作用可能不仅是诱导衰老,更进一步是诱导细胞的凋亡。单细胞凝胶电泳能提供单个细胞中DNA损伤的情况,并可通过彗星尾长的程度估计DNA损伤程度。细胞核中DNA是呈环状附着在核基质上的,细胞分裂时核基质被溶解、抽提,但DNA仍保留核样结构。当断裂剂作用于细胞时,DNA出现

29、单链或双链断裂,即在DNA链上出现缺口,使DNA超螺旋变得松弛。碱性(>13使DNA变性,解螺旋,同时由于缺口暴露了阴电荷,在电场力作用下DNA断片向阳极迁移。但DNA一端仍附着于核DNA,其迁移距离受到限制。DNA的移行可用溴化乙锭染色后在荧光显微镜下观察。未受损的M SC s则只有圆形荧光头部,而无彗星样尾部7,在衰老M SC s中常出现DNA断裂损伤。综上述,我们采用D2gal诱导方法初步建立了复制衰老的M SC s模型,实验结果提示诱导的合适浓度是8g L,该M SC s衰老模型仅为进一步研究干细胞衰老和抗细胞衰老奠定了实验平台,但在细胞衰老的机制及抗衰老等方面还存在一些问题,有

30、待进一步研究。4参考文献1H ayflick L.T he li m ited in v itro lifeti m e of hum an di p lo id cell strains.Exp Cell R es,1965,37:6142636.3B ianco P,R i m inucciM,Grontho s S,et a l.Bone m arrow strom al stem cells:nature,bi o logy,and po tential app licati ons.Stem Cells,2001,19(3:1802192.4M outsatso s IK,T urgem an G,Zhou S,et al.Exogenously regulated stem ce